家蚕是一种完全变态昆虫，幼虫期是其整个生活史中生长发育和储存能量的重要阶段，因此幼虫期致死对家蚕生命周期的影响无疑是巨大的，同时也会对养蚕生产造成严重的经济损失。4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是一种新的幼虫期致死的突变体，本研究在对l-4i突变体遗传分析的基础上，采用图位克隆技术对l-4i的突变基因进行了定位克隆，构建了遗传连锁图，采用qRT-PCR、RNAi、酶活测定和添食特异性抑制剂方法对突变基因进行表达分析和功能验证，证实了家蚕拓扑异构酶基因Bmtop的突变是导致l-4i突变体的主要原因，为进一步研究l-4i突变体致死的分子机制奠定了基础。主要研究成果如下：　　一、l-4i突变体的表型特征与遗传分析　　4龄幼虫致死突变（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是在对家蚕品种P33的饲养过程中发现的一种新的幼虫期致死型突变体，其特征为l-4i突变体幼虫在3龄第2天就表现出体型较正常个体小，活力较差，生长发育缓慢的特征，3龄期延长约2天，4龄起蚕后极少进食，生长发育基本停滞，并于4龄第3~4天陆续死亡。遗传分析初步判断该突变体由常染色体上的一个隐性遗传基因控制，且为同质型（l-4il-4i）致死。　　二、l-4i突变基因的连锁及定位分析　　根据l-4i突变体的遗传规律可以得出该突变性状是由隐性纯合基因控制的，由于l-4i/l-4i有致死性，我们采用基因型为+/l-4i的雄蛾亲本（P2）与C108的雌性亲本（P1）杂交，通过一雄交二雌的方法组配并筛选杂合型F1代群体；筛选出的F1代个体进行自交或与4龄幼虫致死突变体系统中有性状分离的蛾区的亲本进行正反交回交分别组配F2代，BC1F和BC1M群体。然后用P1、F1和P2筛选了家蚕28个连锁群上具有多态性的SSR分子标记；用约400个BC1F、BC1M和F2代群体确定l-4i突变基因所在的连锁群并进行精细定位。连锁分析结果显示l-4i的突变基因位于家蚕第17连锁群；定位结果显示突变基因位于S2865-204和S2865-148两个多态性标记之间，相距约320kb，包含有18个候选基因。　　三、l-4i突变基因的鉴定　　采用RT-PCR方法对位于目标区域内候选基因的转录水平进行了检测但没有找到有明显表达差异的基因，继而又对区域内18个基因的ORF采取克隆测序以期查找差异基因，结果发现大部分基因的ORF没有差异，只有BMgn007081基因的ORF在突变体l-4i中存在两处缺失：在1430-1477位置处缺失48个碱基，在2566位置发生单碱基缺失。　　RNAi初步对BMgn007081基因进行功能验证，结果显示干扰该基因后家蚕出现生长缓慢，食桑少，蚕体较小，活力较差的表型，进入眠期的时间比对照组晚约24小时左右，且后期有的家蚕幼虫陆续开始死亡，这与l-4i突变体的表型类似，因此初步判断BMgn007081基因突变是导致l-4i突变体的主要原因。　　利用荧光定量PCR对BMgn007081基因即家蚕拓扑异构酶基因（Bmtop）在家蚕不同组织和不同发育时期的转录水平进行了检测，获得了该基因的组织表达谱和龄期表达图谱，发现该基因在家蚕体内几乎所有组织和发育时期都有表达，这说明该基因是家蚕体内的重要功能基因，这也从侧面为突变基因的鉴定提供了有力证据。　　四、l-4i突变基因的功能验证　　家蚕基因组数据库中对BMgn007081基因的注释为该基因编码一种家蚕拓扑异构酶III，属于拓扑异构酶IA家族。为了进一步验证该突变基因的功能，通过对野生型家蚕在不同发育龄期添食40 mg/kg、80 mg/kg和160 mg/kg浓度的拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（Camptothecin，CPT），观察家蚕生长发育状况。实验结果显示，添食喜树碱后家蚕表现出生长迟缓，蚕体较小，且后期开始陆续死亡，这与l-4i突变体的自然突变表型非常一致。　　此外我们考察拓扑异构酶在野生型家蚕和l-4i突变体体内的酶活力差异，同时也了检测添食不同浓度CPT的家蚕体内酶活力的变化情况。实验结果显示，l-4i突变体中拓扑异构酶活性远低于野生型家蚕，添食CPT家蚕体内的酶活力也低于对照组家蚕，且随着CPT浓度的增加家蚕体内拓扑异构酶酶活力呈现出递减的趋势。综合上述实验结果判定家蚕l-4i突变体体内的拓扑异构酶编码区缺失而导致酶活力降低是导致l-4i突变体发生并死亡的主要原因。　　上述研究证实了家蚕拓扑异构酶基因Bmtop的突变是导致l-4i突变体产生的主要原因，该研究不仅为阐明4龄幼虫致死突变体的分子机制的阐明提供了重要的理论依据，同时也有助于揭示家蚕生长发育调控机制，而且对预防家蚕突变死亡也具有重要的现实意义。