近年来,由于盲目过量地施用化肥,造成了土壤质量的下降,不利于农业的可持续发展。因此使用安全高效、对环境友好的微生物有机肥来替代化肥在农业生产上展现出良好的应用前景。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqueficiens)SQR9是本实验室从健康黄瓜根际筛选得到的一株根际益生菌,能够在植物根际形成强健的生物膜并有效定殖,兼有促生和生防的效果,在微生物有机肥中已得到广泛应用。由于生物膜的形成是促进植物益生菌根际定殖的关鍵因素,研究菌株SQR9生物膜形成的具体调控机制,有助于增强其在根际的竞争定殖和肥料的应用效果,为我国农业生产中化肥减施、生物肥料替代和农业可持续发展提供理论指导。目前,关于芽孢杆菌生物膜形成的调控机制在模式菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中研究的比较透彻。大量研究揭示了全局性调控蛋白SpoOA是如何通过多种代谢途径和转录因子调控生物膜胞外基质合成基因的表达,但位于调控蛋白SpoOA上游的调控途径被报道的较少。另外在枯草芽孢杆菌中,生物膜细胞群体内存在一种细胞之间嗜食同类的现象,被叫做Cannibalism,能够促进生物膜的形成,而其他类的根际促生芽孢杆菌中是否存在这种现象还未见报道。本文主要围绕SQR9生物膜的调控机制展开研究。一方面通过SQR9菌株突变体文库的筛选,采用转座子插入位点分析、基因敲除以及突变体基因回补等方法鉴定了一个能够影响SQR9生物膜形成和根际定殖的基因。然后通过显微观察、转录水平分析和细菌双杂交等手段探索了该基因参与SQR9生物膜调控的分子机制。另一方面,以实验室鉴定出一个SQR9产生的新型次级代谢产物Bacillunoicacid A/B为基础。本文揭示了该新型活性物质作为毒素物质,介导SQR9生物膜形成过程中细胞之间嗜食同类的机制—Cannibalism,进而阐释了该机制对SQR9生物膜形成的影响。获得的主要研究结果如下:1.利用SQR9菌株的突变体文库,我们在3000个突变体菌株中筛选得到了一株生物膜形成缺陷的突变体。结合转座子插入位点的分析以及SQR9全基因组序列的比对,确定导致生物膜缺陷的基因为ftsE,是操纵子ftsEX中的第一个基因。该基因编码ATP结合蛋白FtsE,与跨膜蛋白FtsX共同组成ABC转运蛋白FtsEX。接着,利用双交换同源重组的基因敲除方法,获得菌株SQR9 AftsE(后面简称△ftsE)。发现AftsE与野生型SQR9生长速度相似,但在MSgg培养基中生长20 h后的生物膜明显弱于野生型。随后构建了 △ftsE的互补菌株AftsE pNW33NftsEX,其生物膜的形成能力恢复至野生型SQR9的同等水平。基因敲除整个操纵子ftsEX后得到的菌株SQR9 AftsEX也同样影响生物膜的形成。最后,通过绿色荧光蛋白(GFP)标记FtsEX,发现该ABC转运蛋白定位在SQR9的细胞膜上。2.基于文献调研,我们推测ABC转运蛋白FtsEX具有调控肽聚糖水解酶CwlO的功能。将SQR9中的cwlO基因克隆至高拷贝载体pNW33N上,获得高拷贝载体pNW33N-cwlO。该载体转入菌体后,过表达的cwlO基因会引起细胞损伤,暗示着SQR9中的Cw1O蛋白具有肽聚糖水解酶的活性。通过cwlO基因的敲除和生物膜的测定,发现菌株SQR9 AcwlO(后面简称△cwlO)也能够影响生物膜的形成。之后我们将携带自身启动子的cwlO基因插入菌株AcwlO中的淀粉酶基amyE位点,获得cwlO基因单拷贝的互补菌株△cwlO amyE::cwlO。经过生物膜的定性和定量测定,互补菌株△cwlO amyE::cwlO生物膜的形成能力恢复至野生型SQR9的水平。进一步结合突变体菌株在黄瓜根际定殖的分析结果,发现菌株△ftsE和AcwlO在黄瓜根表的定殖能力较野生型SQR9均显著下降,且下降程度相似,表明FtsEX-Cw1O途径参与了 SQR9的生物膜形成和根际定殖行为。最后,通过显微观察野生型菌株SQR9和AcwlO生物膜中菌体的聚集形态,发现AcwlO并没有因其肽聚糖水解酶功能缺陷而影响到细胞的分离。比较它们分泌的胞外DNA的量,发现AcwlO胞外DNA的因分泌与SQR9相比没有显著变化,表明Cw1O对生物膜形成的影响主要不是依赖其肽聚糖水解酶的活性调控的。另外,我们还探索了 SQR9中一些其他的肽聚糖水解酶突变体对生物膜形成的影响,发现这些肽聚糖水解酶均没有显著影响生物膜的形成。3.通过基因敲除技术,构建了双突变体菌株SQR9 AcwlO△ftsE(后面简称AcwlO△ftsE)。我们发现菌株△ftsE、△cwlO和△cwlO△ftsE在生物膜形成早期(18 h左右)明显滞后于野生型SQR9。但是到生物膜形成后期(42h左右),突变体形成的生物膜从厚度与外观形态上都与野生型SQR9相似。这表明FtsEX-Cw1O的缺失造成了生物膜的延迟,FtsEX-Cw1O很可能调控生物膜早期发展的正常进程。另外,菌株△ftsE、AcwlO和△cwlO△ftsE形成的菌落形态都呈现出较简单的空间结构,与野生型SQR9形成的有复杂褶皱结构的菌落形态显著不同,这暗示着突变体形成的胞外基质可能有所减少。通过胞外基质的显微观察及对胞外多糖的测定,发现菌株AftsE、AcwlO和△cwlO△ftsE的胞外基质以及胞外多糖的分泌较野生型均有所下降。利用实时荧光定量PCR对生物膜相关基因进行定量分析,发现与野生型SQR9相比,生物膜胞外基质合成相关的基因(epsD、tapA和bslA)的表达量在菌株△ftsE、△cwlO和△cwlO△ftsE中均有下调。且spoOA调控途径上的三个基因abrB、sinI和spoOA的表达量呈现相应变化,表明突变体菌株中的spo0A途径受到了影响。最后,通过测定三个膜结合组氨酸激酶(KinB、KinC和KinD)突变体的生物膜形成能力,发现只有膜结合组氨酸激酶KinB和KinD的缺失能够影响SQR9生物膜的形成,且菌株△cwlO△tsE和△kinB△kinD造成SQR9生物膜减弱的程度较为一致。再结合细菌双杂交实验,我们推测FtsEX-CwlO可能会通过CwlO与膜结合组氨酸激酶KinB和KinD发生互作,激活spo0A途径,从而调控生物膜的形成。4.为了研究SQR9生物膜菌体中是否存在细胞之间嗜食同类的现象(Cannibalism),我们首先使用扫描电镜对SQR9生物膜进行观察。发现SQR9生物膜菌体中存在部分被裂解的细胞,它们有可能是被毒素物质裂解的细胞(Cannibalized cells)。通过测定并比较SQR9(野生型)、突变体SQR9MA(免疫机制被破坏)和突变体SQR9MV(不能合成毒素物质)这三个菌株生物膜形成过程中的细胞裂解情况和胞外DNA释放等特征,初步确定了 Cannibalism在SQR9生物膜中存在的可能性。为了研究毒素物质Bacillunoic acid A/B诱导自身免疫能力的机制,我们通过5’端步移和gfp作为报告基因的分析方法,对不同长度的包含bnaA-B(参与自身免疫机制的操纵子)启动子的片段进行了分析,找到了启动子所在的区域,并用软件预测了转录起始位点(+1),-10区及-35区的位置。然后将GFP标记的bnaA-B启动子分别导入SQR9和突变体SQR9MV中,构建菌株SQR9-PbnaA-GFP和SQR9MV-PbnaA-GFP。通过荧光显微镜观察这两个构建菌株的启动子被诱导表达的情况,以及在添加不同发酵液(SQR9发酵液和SQR9MV发酵液)条件下的启动子诱导表达情况,发现bnaA-B操纵子的启动子受发酵液中的新型活性物质Bacillunoic acid A/B的诱导。接下来,通过观察比较两个构建菌株SQR9-PbnaA-GFP和SQR9MV-PbnaA-GFP形成的生物膜中菌体bnaA-B操纵子的启动子被差异诱导及菌体被裂解的情况,揭示了 SQR9在生物膜形成过程中存在细胞之间嗜食同类的机制(Cannibalism)。最后通过测定并比较SQR9(野生型)、突变体SQR9MA(免疫机制被破坏)和突变体SQR9MV(不能合成毒素物质)这三个菌株形成的生物膜水平,揭示了 Cannibalism参与并能够促进生物膜的形成,当毒素物质Bacillunoic acid A/B缺失而无法介导Cannibalism的情况下,生物膜的形成会减弱。综上所述,本文研究了 FtsEX-CwlO及Cannibalism参与并调控SQR9生物膜形成的相关机制,为增强这一类根际促生芽孢杆菌的根际定殖和发挥其植物益生功能提供了理论依据。