研究背景及目的:在全世界范围内食管癌是导致肿瘤死亡的第八大常见肿瘤,而我国是食管癌发病率和死亡率最高的国家,其发病率居恶性肿瘤的第四位,五年生存率低于10%。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征,是临床上绝大多数肿瘤患者的致死因素。随着人类基因组计划的完成及蛋白质组学研究的进展,人们逐渐意识到肿瘤转移的发生与肿瘤转移相关基因及肿瘤转移性相关蛋白的表达密切相关。阻止肿瘤表达的信号因子及转移相关因子就有可能防止恶性肿瘤的发生与转移。寻找肿瘤转移特异性功能性抗原蛋白以及具有重要功能的基因,为阻断肿瘤转移提供有价值的靶点已逐渐成为肿瘤研究的新热点。本研究是采用中国协和医科大学肿瘤研究所抗体工程实验室首创的“功能性抗体库筛选肿瘤相关功能性基因”的新技术,重点研究了抗人食管癌细胞的单抗,并在体外筛选鉴定食管癌转移相关功能性单抗,初步确定了某些功能性单抗识别的功能性抗原的分子量,为分离获得人食管癌转移相关的功能性基因奠定了重要的基础。方法:本研究根据对前期的杂交瘤技术、经酶联免疫吸附实验确定后获得的485株抗人食管癌组织细胞的单克隆抗体进行了体外功能的检测、分析和鉴定。首先采用免疫荧光法检测485株单抗对应的抗原表达谱。然后通过粘附实验、迁移实验从485株单抗中检测出明显抑制人食管癌迁移或粘附的22株单抗,在此基础上通过体外侵袭实验筛选出明显抑制人食管癌细胞侵袭的7株单抗。选择1株抗转移作用较强的单抗3D11,通过Protein G亲和层析柱纯化杂交瘤上清,获得纯度大于90%的单抗。对该抗体识别的抗原蛋白采用细胞免疫荧光及免疫组化等技术进行了亚细胞定位及组织表达特异性的研究。并提取人食管癌细胞及食管癌移植瘤的总蛋白,进行Dot Blot和Western Blot分析,初步证明了该单抗识别的功能性蛋白的分子量。实验数据用means±SD表示,SPSS统计软件处理,采用方差分析和Student’s t检验方法统计相关数据。结果:1.免疫荧光法检测485株单抗对应的人食管癌抗原表达谱。结果发现109株识别的抗原蛋白有表达,其中14株单抗对应的抗原表达强阳性(+++),47株中等强度阳性表达(++),48株弱阳性表达(+)。2.粘附实验检测分析了485株单抗对人食管癌细胞与正常血管内皮细胞粘附的影响。结果显示40株单抗显著抑制人食管癌细胞与正常血管内皮细胞的粘附。抑制率达31~76%,其中32株单抗与对照组相比P<0.05,具有显著性差异。还有8株表现为对食管癌细胞与正常血管内皮细胞有促进作用。3.迁移实验检测分析了485株单抗对人食管癌细胞迁移能力的影响。结果发现其中有70株单抗明显抑制人食管癌细胞的迁移,49株抑制率可以达30%以上,与对照组相比其P<0.05,具有显著的差异。4.侵袭实验检测了粘附和迁移抑制率较强的22株单抗对食管癌的侵袭能力的影响。结果提示7株单抗明显抑制人食管癌细胞的侵袭,抑制率达30%以上,与对照组相比其P<0.05,具有显著性差异。说明这7株单抗可以通过阻断转移过程中的迁移、侵袭等环节,从而抑制肿瘤转移的发生。5.成功获得了1株体外显著抑制人食管癌细胞迁移(抑制率为46.53%)、侵袭(抑制率为73.0%)、粘附(抑制率为13%)的功能性单抗3D11。免疫荧光定位在细胞膜上,免疫组化结果显示在肿瘤组织中高表达,而在正常食管组织中表达很低。Western Blot实验分析发现,该抗体识别的抗原蛋白的分子量为100kDa或300kDa为分离该功能性抗原/基因奠定了重要基础。结论:1.从485株抗人食管癌细胞的单抗杂交瘤株中,经体外免疫荧光方法筛选获得了109株表达相应抗原蛋白的功能性单抗。2.采用体外粘附实验筛选成功地获得了40株明显抑制人食管癌细胞与正常食管内皮细胞粘附的功能性单抗。3.通过体外迁移实验筛选出49株能显著抑制人食管癌细胞迁移的功能性单抗4.在通过体外粘附实验和迁移实验筛选的功能性单抗中选择22株单抗进行侵袭实验。试验结果显示有7株单抗明显抑制人食管癌细胞侵袭,抑制率为32～80%,与对照组相比具有显著性差异(p<0.05)。5.成功获得了体外明显抑制食管癌转移的功能性单抗3D11, Dot Blot和Western Blot分析,初步证明该单抗识别的功能性蛋白的分子量为100kDa或300kDa。为寻找肿瘤转移环节的分子靶向提供可能的肿瘤分子标志。