前言 关节软骨损伤后自我修复能力低下,临床缺乏有效的治疗手段,因此一直是骨科领域的一个难点。我们采用组织工程学的方法,应用生物可降解材料-透明质酸苄基酯凝胶复合软骨细胞来修复兔关节软骨的缺损,观察其修复效果,探讨其作为移植载体的可行性。 材料与方法 1.软骨细胞的获取与培养 取2周龄新西兰白兔2只,过量戊巴比妥钠静脉注射处死,无菌条件下切取兔关节软骨,剪成1mm³大小,注意保持关节软骨呈湿润状态。37℃下按下列程序依次消化:①2mg/ml透明质酸酶消化45分钟;②2mg/ml胰蛋白酶消化45分钟;③4mg/mlⅡ型胶原酶消化3小时,冲洗离心（1500r/min）5分钟,将沉淀物置人含15%胎牛血清DMEM培养基中进行培养,取少量原代软骨细胞涂片后用Ⅱ型胶原抗体SABC免疫检测,染成棕黄色,说明分泌型胶原,证实为软骨细胞。将原代软骨细胞收集后加入含有20%小牛血清的DMEM培养液中,制成软骨细胞悬液,放人37℃ 5%CO₂培养箱中恒温培养,细胞增殖形成单层细胞后,镜下观察80%软骨细胞融合,进行传代培养,观察细胞形态、贴壁及存活情况。 2.软骨细胞在透明质酸苄基酯凝胶中的培养将传代2代的关节软骨细胞制成软骨细胞悬液（1×10⁶/ml）注入透明质酸苄基酯凝胶中（浓度为500μg/ml）制成复合体,加入DMEM培养液,放入37℃ 5%CO₂培养箱中恒温培养,72h后首次换液,以后隔日换液,观察细胞形态、黏附性、存活情况和增殖能力。