随着人们对核酸分子认识和研究的不断深入,各种设计简单、成本低廉的核酸荧光探针相继被开发,展现了其在生化分析领域重要地位。功能核酸,核酸分子技术的重要产物之一,它的出现突破了传统核酸荧光探针常用于癌基因诊断、基因表达的检测等限于核酸分子水平上的应用。功能核酸主要指具有识别功能和催化功能的核酸序列,可以通过体外筛选技术获得,极大的拓宽了待分析物范围,且易于体外设计和化学合成。功能核酸荧光探针重复性好、灵敏度和选择性高,在环境监测、食品分析和医学诊断等领域被广泛应用。然而,核酸探针在复杂生物和环境样品中应用时会受到一些限制,例如:核酸分子容易被各种酶降解;复杂体系中其他蛋白和游离核酸都可能对核酸探针产生吸附和结合作用,导致出现假信号和脱靶效应等。近年,人们利用所开发的各种新型纳米材料和核酸自组装技术,来解决上述问题。但纳米材料始终对细胞具有一定毒性,其与功能核酸之间的相互作用也可能影响识别和催化功能。因此,核酸荧光探针的稳定性和抗干扰能力始终是一项亟待解决的重要科学问题。基于对映异构体概念,科学研究者们开发出非自然体系的右旋氨基酸构建多肽和蛋白质。在自然界中,左旋蛋白酶能够识别左旋底物链,产生催化作用催化切断左旋底物链。研究表明,右旋蛋白酶也能够识别相应的右旋底物链,发生类似的催化切割反应。而且,右旋蛋白酶不会对左旋底物链产生作用,反之亦然。这种特性被称为互惠手性底物特异性(reciprocal chiral substrate specificity)。与蛋白分子相类似,自然体系中的核酸分子均由右旋核苷酸构成。同样基于对映异构体概念,人们合成了非自然的左旋核苷酸,用于构建一种新型核酸分子——左旋核酸。人们将左旋核酸与自然的右旋核酸进行对照发现,两者物理化学性质相似。左旋核酸之间也能够依照碱基配对原则形成双链结构,但是不会与右旋核酸发生杂交。同时,由于生物体中立体选择性的存在,左旋核酸不受自然核酸酶的降解,不与其他非特异性蛋白吸附,具有非常好的生物稳定性和抗干扰能力。本论文基于互惠手性底物特异性,利用左旋核苷酸构建具有特殊功能的左旋核酸序列。该种序列结合了功能核酸和左旋核酸的特性,不仅能够对各种目标物有高亲和力、高特异性的识别作用,还具有抗酶切、抗非特异性蛋白吸附和其他核酸干扰的能力。由此,本文构建了一系列设计简单、生物稳定性好和抗干扰能力强的左旋功能核酸荧光探针,用于与生命体息息相关的小分子和各种金属离子的检测,并将其成功应用到河水、血清、鱼体组织和细胞等复杂样品中。具体内容如下:(1)在第2章中,我们基于现存的小分子核酸适配体,合成了相应的左旋核酸适配体,验证了该左旋核酸适配体对于小分子的识别能力及它们优异的生物稳定性。小分子孔雀石绿(MG)常于水产业中用以抗菌,但是MG对人类和动物都具有毒性,所以MG在鱼类食品安全方面有较大影响。在此,我们以MG为目标物,基于MG与其左旋RNA核酸适配体结合能产生强荧光现象,构建了一种非标记荧光增强“turn-on”型核酸探针用于MG的检测。该探针对MG有很好的响应,其检测范围为0.1～5μM,线性范围为0.1～1μM,检测限为65 nM。在鱼体组织和湖水样品中,该MG探针也表现出较好的响应性能。随后,我们又以EA为目标物,基于EA与其左旋DNA核酸适配体结合作用大于所设计的互补短链与其适体之间的杂交作用,构建了一种荧光增强型置换链探针用于EA的检测。实验验证了该探针的可行性,体现了该种左旋核酸适体荧光探针对小分子检测的普适性。(2)在第3章中,我们利用富T序列对汞离子的特异性识别作用和富C序列对银离子的特异性识别作用,分别构建了对汞离子和银离子进行检测的左旋核酸荧光探针。实验验证了左旋富T或富C序列分别对于汞离子和银离子的特异性识别作用,也可以形成类似“T-Hg2+-T”或“C-Ag+-C”的结构。由此,我们在这两种左旋序列的两端分别修饰荧光基团和猝灭基团,直接构建成荧光探针。当有汞离子或银离子存在时,探针首尾两端将相互靠近而致荧光猝灭,以此对汞离子或银离子进行定量检测。其中,汞离子探针检测的线性范围为25～250 nM,检测限为20 nM;银离子探针检测的线性范围为10～100nM,检测限为6.6nM。同时,该种左旋核酸序列表现出在核酸酶等复杂样品中不被降解的特性。因此,该种左旋核酸荧光探针灵敏度高、选择性好、稳定性强,在湘江水样品中应用时也表现出与缓冲液中一样好的响应性能。(3)在第4章中,我们针对具有重要生物学意义的钾离子和它的核酸适配体进行了研究。钾离子在生命体系具有重要生物学功能,参与多种生命活动的调节作用。因此,在生理条件下对钾离子进行检测具有非常重要的意义。天然的右旋凝血酶核酸适配体(D-TBA)能够识别钾离子,形成构型单一的G四联体结构(D-G四联体),人们以此构建用于钾离子检测的D-TBA荧光探针。但是D-TBA作为凝血酶的核酸适配体,对于钾离子无特异性识别。并且,D-G四联体及其被降解后产生的磷酸鸟嘌呤、脱氧鸟苷(dGMP)和脱氧鸟苷(dG)均具有细胞毒性。本工作中所合成的左旋TBA(L-TBA),同样能够与钾离子结合形成L-G四联体。基于这种特性,我们构建了 L-G四联体荧光探针用于钾离子在细胞内的检测和成像。实验中,我们通过圆二色谱表征了 L-TBA的构型,并利用条件优化该L-G四联体探针在水溶液中的响应性能和在细胞中的成像功能。实验证明L-TBA具有优异的抗核酸酶降解能力,也不与非特异性蛋白分子、凝血酶和细胞结合。因此,L-TBA不仅能有效避免假阳性信号的产生,对于细胞也基本无毒性作用。该L-G四联体荧光探针克服了天然D-TBA的缺陷,从而能更好更准确地进行细胞内钾离子的检测和成像。(4)在第5章中,依照能特异性识别铅离子的GR-5脱氧核酶,我们构建了一种基于左旋GR-5脱氧核酶(L-GR-5DNAzyme)的“turn-on”型荧光探针用于铅离子在复杂样品中的检测。实验证实,L-GR-5 DNAzyme与天然GR-5脱氧核酶(D-GR-5DNAzyme)一样,能够识别铅离子而产生催化活性,符合对映异构体互惠手性底物特异性特征。并且,L-GR-5 DNAzyme不受核酸酶的降解、单链DNA结合蛋白的吸附和其他天然核酸的干扰。带有左旋RNA碱基的底物链也能够在常温条件下长时间保持其原本性质,稳定性远胜于天然底物链。本工作中的探针采用双猝灭基团策略,获得了较好的灵敏度,其检测限为3nM。更重要的是,该探针不仅应用在湘江水样品中实现应用,还在5%胎牛血清(FBS)样品中对铅离子有很好的响应,并且表现出优于右旋脱氧核酶荧光探针的信背比。