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背景:核酸纳米结构包括DNA纳米结构和RNA纳米结构。目前,研究人员已成功构建了一系列结构精巧、功能广泛的核酸纳米结构,这些核酸纳米结构的精巧程度通常和参与组成的核酸链的数量呈正相关,但是大量的核酸链参与组装纳米结构,不仅增加了合成成本,也使实验操作变得繁琐。因此,简单的核酸链组成和组装过程,将会是一种理想的核酸结构构建方式。根据中心法则,目前建立的方法可在不同水平沉默目的基因,在转录后水平发生的基因沉默,被称为转录后基因沉默。当前建立的转录后基因沉默方法多集中于细胞质中,缺少对细胞核内RNA直接干扰的方法,将具有简单的核酸链组成、较好的可编程性和生物相容性的核酸纳米结构应用于此领域,将会建立一种安全有效的基因沉默新方法。核酸无膜细胞器是指细胞内由核酸组成的无膜聚集体,目前对其形成机制和功能的体内外研究资料都较少,而将核酸纳米结构领域与无膜细胞器领域结合,可促进二者的共同发展。目的:1构建组成成分简单、组装便捷和功能广泛的DNA纳米结构和RNA纳米结构;2建立一种可在细胞核内阻断mRNA翻译的基因沉默新方法;3将核酸纳米结构领域和无膜细胞器领域相结合,促进二者共同发展。方法与结果:1 DNA无膜细胞器的设计、组装及表征根据回文序列特征和利用Tiamat软件设计了两组(具尾和不具尾)多回文结构域的DNA序列。通过一步退火法组装两组多回文结构域的DNA,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)和琼脂糖凝胶电泳观察到两组DNA均自组装形成高分子量聚集体,且随着回文结构域数目的增加,形成的聚集体更大。进一步利用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察到组装后的两组DNA均可形成微米级颗粒;将两组DNAμPs低速离心后,发现其均具有相分离性质,因此将组装形成的DNA纳米结构称为DNA无膜细胞器–DNA微米颗粒(DNA microparticles,DNAμPs)。离心分离法半定量结果表明各不具尾DNAμPs的产率无明显差异,约为96%;具尾DNAμPs的产率随着回文结构域数目的增加,逐渐提高,产率范围为90%–20%。通过LSCM和离心分离法发现DNA浓度和镁离子浓度可影响具尾DNAμPs的组装,随着DNA浓度的减小,DNAμPs粒径逐渐减小,当DNA浓度为0.63μM时,观察不到DNAμPs;随着镁离子浓度的增加,DNAμPs聚集程度逐渐增加,当镁离子浓度为22.5 mM时,DNAμPs相互融合形成大聚集体,有明显相分离现象;而当镁离子浓度为3 mM时,仅观察到极少量疏松的网状DNA,无明显相分离现象。2 DNA无膜细胞器对巨噬细胞免疫刺激作用及单链DNA的捕获作用研究将硫代磷酸化的CpG 1826(CpG 1826–phosphorothioate,CpG 1826–ps)连接到4条多回文结构域DNA的3’端,成功设计并组装了4条多回文结构域的免疫刺激CpG–DNAμPs。酶联免疫吸附试验(enzyme–linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示各CpG–DNAμPs均可增强巨噬细胞分泌免疫因子IL–6、IL–12和TNF–α。细胞计数试剂盒–8(cell counting kit–8,CCK8)实验表明CpG–DNAμPs对RAW 264.7巨噬细胞的存活率无影响。非变性PAGE实验证明具尾DNAμPs在体外可捕获单链DNA(T),在37°C时,各具尾DNAμPs对T链的捕获率约为50%;在22°C时,7 PA对T链的捕获效率约为88%,其余3种类型的具尾DNAμPs对T链的捕获率约为100%。3 DNA无膜细胞器捕获癌细胞中致癌miR–21,从而致死癌细胞的作用研究将反义寡核苷酸21(antisense oligonucleotide 21,ASON 21)连接到多回文结构域DNA的3’端,设计成不同回文结构域数目的DNAμP21(n P21,n=1–7)。通过一步退火法组装各组DNAμP21,利用LSCM观察到7 P21、6 P21、5 P21、4 P21和3 P21呈颗粒状,2 P21、1 P21不易形成颗粒状。非变性PAGE实验发现DNAμP21在体外均可不同程度的捕获miR–21,7 P21的捕获率约为40%,6P21、5 P21和4 P21的捕获率约为85%,其余DNAμP21的捕获率约为100%。LSCM观察到各DNAμP21组的细胞核(蓝色荧光)周围有大量Cy 3–DNAμP21(红色荧光),表明DNAμP21已进入MCF–7乳腺癌细胞。实时荧光定量PCR(real–time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)实验发现DNAμP21可下调MCF–7乳腺癌细胞中miR–21水平,随着回文结构数目的减少,DNAμP21对miR–21水平的下调作用逐渐增强。CCK8实验结果表明DNAμP21可致死MCF–7乳腺癌细胞,随着回文结构域的减少,DNAμP21对MCF–7乳腺癌细胞的致死作用逐渐增强;随着给药时间的增加,21–1 P对MCF–7乳腺癌细胞的致死作用逐渐增强,当给药时间为72 h时,细胞存活率约为30%;随着给药量的增加,21–1 P对MCF–7乳腺癌细胞的致死作用逐渐增强,当给药量达到2400 nM时,细胞存活率约为30%。4 RNA无膜细胞器的设计、组装及表征利用多回文结构域的DNA在体外转录得到多回文结构域的RNA(7 C、6 C、5 C和4 C)。通过琼脂糖凝胶电泳、非变性PAGE和LSCM实验分别考察退火程序和镁离子浓度对RNA无膜细胞器–RNA微聚体(RNA microaggregations,RNAμAs)组装的影响,结果表明镁离子的存在有利于RNAμAs的形成,高温退火程序会阻碍RNAμAs形成,并且根据体内具有恒温和丰富的离子环境,推测出RNAμAs适用于体内的自组装。5 RNA无膜细胞器的基因沉默作用研究从构建的重组质粒GFP–pcDNA3.1、7 P+GFP–pcDNA3.1和NC+GFP–pcDNA3.1中扩增GFP、7 C+GFP和NC+GFP的DNA,并通过体外转录获得对应的mRNA,将转录得到的GFP、7 C+GFP和NC+GFP的mRNA通过琼脂糖凝胶分析,实验结果表明RNAμAs可降低GFP mRNA在琼脂糖凝胶中迁移率。将重组质粒给予Hela细胞48 h后,分别通过LSCM、流式细胞术和蛋白免疫印迹法检测GFP表达量,结果显示RNAμAs可抑制Hela细胞中GFP的表达,沉默效率约50%。CCK8和蛋白免疫印迹法实验结果表明RNAμAs对Hela细胞存活率和细胞内功能无影响。研究结论:1成功构建了仅由一条链组装的DNA无膜细胞器–DNAμPs,此DNAμPs可应用于运载功能性核酸药物进入细胞,从而增强免疫反应和抑制癌细胞增殖;2成功构建了仅由一条链组装的RNA无膜细胞器–RNAμAs,并推测此RNAμAs适用于体内自组装;3初步建立了一种转录后基因沉默的新方法:利用体内自组装形成的RNAμAs,捕获目的蛋白的mRNA,从而阻止目的蛋白的mRNA进入细胞质,进而阻碍目的蛋白的表达;4将核酸纳米结构领域与无膜细胞器领域相结合,促进二者共同发展。