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【背景与目的】聚乙二醇干扰素-α（Peg-IFN-α）治疗慢性乙型肝炎（CHB）的疗效较差,但其原因未明。以往的研究报道显示,在含乙型肝炎病毒（HBV）基因组的肝癌细胞系中,胆汁酸具有促进HBV复制及抑制IFN-α抗HBV活性的功能;在不含HBV基因组的肝癌细胞系中,胆汁酸可抑制IFN-α信号通路,这些体外实验证据提示胆汁酸可能影响CHB患者的IFN-α治疗效果。因此,本研究旨在探讨胆汁酸在CHB患者Peg-IFN-α疗效中的作用及其调控机制,探明CHB患者IFN-α疗效差异的原因,为改善IFN-α对CHB患者的疗效及其预后提供新的思路。【方法】1.采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术定量检测20例慢性HBV携带状态、50例HBe Ag阳性CHB[包括18例Peg-IFN-α治疗应答（SR）和19例Peg-IFN-α治疗应答不佳（NR）的HBe Ag阳性CHB患者]、20例非活动性HBs Ag携带状态、20例HBe Ag阴性CHB患者和20例健康对照者的血清胆汁酸组分,以揭示CHB患者的胆汁酸谱特征;采用相关性分析探讨胆汁酸与HBV标志物之间的相关性;动态监测CHB患者Peg-IFN-α治疗过程中HBs Ag和HBe Ag的转阴率,以评估胆汁酸对CHB患者Peg-IFN-α疗效的影响。2.采用流式细胞术（FCM）分析74例慢性HBV感染者[49例血清总胆汁酸（TBA）水平正常,25例血清TBA水平升高]的外周血淋巴细胞亚群;采用FCM技术检测50例慢性HBV感染者（30例血清TBA水平正常,20例血清TBA水平升高）CD3+CD8+T细胞和自然杀伤细胞（NK）的胞内细胞因子[干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）]、细胞毒性颗粒（颗粒酶B、穿孔素）的水平,以评估CD3+CD8+T细胞和NK细胞的免疫效应功能;采用FCM技术检测牛磺胆酸（TCA）刺激外周血单个核细胞（PBMC）后CD3+CD8+T细胞和NK细胞的百分比及其分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的水平,以评估TCA在体外对CD3+CD8+T细胞和NK细胞功能的影响;采用FCM技术检测TCA灌胃C57BL/6小鼠（携带r AAV8-1.3HBV）2周后外周血CD3+CD8+T细胞和NK细胞的百分比及其分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的水平,以评估TCA在体内对CD3+CD8+T细胞和NK细胞免疫效应功能的影响;采用FCM技术检测IFN-α和TCA+IFN-α刺激PBMC后CD3+CD8+T细胞和NK细胞分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的水平,以评估TCA对IFN-α免疫调节活性的影响。3.采用相应试剂盒检测胆汁酸/IFN-α刺激HepG2.2.15和HepAD38细胞（含稳转的HBV基因组）后上清液HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的水平,以确定胆汁酸对HBV复制的作用;采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测IFN-α信号通路中信号转导和转录激活因子（STAT）磷酸化及抗病毒蛋白的表达水平,以揭示鹅去氧胆酸（CDCA）对IFN-α信号通路的作用。【结果】1.胆汁酸抑制慢性乙型肝炎患者聚乙二醇干扰素-α的抗病毒疗效慢性HBV感染不同自然史时期的血清胆汁酸谱不同,HBe Ag阳性CHB患者的总胆汁酸水平显著高于健康对照及其他时期的慢性HBV感染者,并且以TCA、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）、甘氨胆酸（GCA）这三种结合型胆汁酸升高为主,其中TCA的升高倍数最大。胆汁酸（尤其是TCA）水平与HBV标志物（HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA）浓度呈正相关。此外,HBe Ag阳性CHB患者Peg-IFN-α治疗SR组和NR组的血清胆汁酸谱不同,NR组的胆汁酸水平显著高于SR组;其中TCA的升高倍数最大,TCA水平越高,HBs Ag和HBe Ag的转阴率越低,Peg-IFN-α的疗效越差。2.牛磺胆酸通过损伤CD8+T细胞和NK细胞的功能进而抑制IFN-α的免疫调节活性在慢性HBV感染者中,胆汁酸的水平越高,外周血CD3+CD8+T细胞和NK细胞的数量越低并且分泌IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B、穿孔素等细胞因子/细胞毒性颗粒的能力越差,提示胆汁酸可减少CD3+CD8+T细胞和NK细胞的数量并损伤其免疫效应功能;其次,在细胞/动物实验中均证实,TCA对CD3+CD8+T细胞和NK细胞的百分比影响最大,可减少CD3+CD8+T细胞和NK细胞的数量并损伤其分泌细胞因子（IFN-γ、TNF-α）/细胞毒性颗粒（颗粒酶B、穿孔素）的功能,亦可抑制IFN-α上调CD3+CD8+T细胞和NK细胞功能的免疫调节活性。3.鹅去氧胆酸通过下调STAT磷酸化进而抑制IFN-α的抗HBV作用在HepG2.2.15和HepAD38细胞中证实,多种胆汁酸均可促进HBV复制,其中CDCA促进HBV复制的能力最强。此外,CDCA可通过下调IFN-α诱导的STAT1和STAT2磷酸化,导致抗病毒蛋白OAS1、Mx A生成减少,进而促进HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA及HBV core、pg RNA、pre S1 m RNA的表达。【结论】在肝细胞外,TCA通过损伤CD3+CD8+T细胞和NK细胞的免疫效应功能进而抑制CHB患者的Peg-IFN-α疗效;在肝细胞内,CDCA通过下调STAT1和STAT2磷酸化进而抑制IFN-α的抗HBV作用。本研究发现,血清高胆汁酸水平是部分CHB患者IFN-α疗效不佳的原因之一,降低胆汁酸（尤其是TCA）水平有望成为提高CHB患者IFN-α疗效的优化方案。