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第一部分人脑胶质瘤放射敏感性相关miRNA的筛选和鉴定目的:筛选和鉴定可能参与调节人脑胶质瘤细胞放射敏感性的miRNA。方法:1.人脑胶质瘤细胞系U87MG、U251MG、SHG-44放射敏感性检测。给予各种人胶质瘤细胞不同放射剂量照射,绘制生长曲线,流式细胞仪检测各细胞系在不同放射剂量处理后的凋亡率,判定各细胞系放射敏感性差异;2.选择放射不敏感胶质瘤细胞系作为研究对象。不同放射剂量处理所选细胞系,MTT检测其对应的生长抑制率,结合曲线拟合分析,确定后续实验组放射处理剂量,即生长抑制率为50%时的放射剂量;3.放射处理方案:模拟人脑胶质瘤分割照射放疗方案,即给予所选细胞2Gy/天,5天/周的放疗方案,剂量率400cGy/分;4.miRNA芯片检测放射处理前后所选细胞miRNA表达谱,分析并找出差异表达miRNA;5.利用quantitive real-time PCR对miRNA芯片部分结果进行验证。结果: 3种胶质瘤细胞的细胞增殖都随着放射剂量的增加而减慢,但是3种细胞的放射敏感性有所不同。5Gy处理组中,U87MG细胞增殖在随后的7天内与对照组相比无统计学差异,U251MG和SHG-44的细胞增殖与对照组相比均明显下降(P<0.05);10Gy处理组中,3种细胞的细胞增殖均受到明显抑制(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示放射线能够诱导肿瘤细胞凋亡,各细胞凋亡率都随放射剂量的增加而增加,并与放射剂量呈正相关。在相同的剂量点上3种细胞株凋亡率大小依次是U87MG < U251MG < SHG-44。以上结果显示,U87MG细胞对放射治疗不敏感,为了研究miRNA在胶质瘤细胞放射抗拒中的调节作用,故选择U87MG细胞作为我们的后续研究对象。MTT检测不同放射剂量下U87MG细胞生长抑制率,曲线拟合分析结果示18.8Gy放射剂量能抑制U87MG细胞50%增殖。按2Gy/天,5天/周的放疗方案,剂量率400cGy/分的放疗方案,给予总剂量18.8Gy后,提取总RNA,miRNA芯片检测未放射处理组U87MG细胞及放射处理组U87MG细胞的miRNA表达谱,21个miRNA在放射处理后较未处理组U87MG细胞发生了明显的上调或下调(>2倍)。表达下调的是hsa-miR-181a、hsa-miR-521、hsa-miR-302b*、hsa-miR-206、hsa-miR-582、hsa-miR-518b、hsa-miR-107、hsa-miR-620,表达上调的是hsa-miR-22、hsa-miR-500、hsa-miR-601、hsa-miR-379、hsa-miR-641、hsa-miR-548d、hsa-miR-191、hsa-miR-335、hsa-let-7g、hsa-miR-646、hsa-miR-22_MM1、hsa-miR-9*_MM2、hsa-miR-451。既往研究表明,miR-521在前列腺癌的放射敏感性调节中有肯定的作用,let-7g参与了肺癌的放射敏感性调节,miR-181a在肿瘤发生中有重要的意义,但目前尚未见miRNA与胶质瘤放射敏感性相关报道。Quantitive real-time PCR结果显示:miR-181a和miR-521的表达在放射处理后较未处理U87MG细胞显著降低,与芯片结果一致。结论:1.与U251MG、SHG-44细胞相比较,U87MG细胞对放疗不敏感;2.U87MG细胞的miRNA表达谱在放射处理前后存在明显的差异,这些差异miRNA可能参与了U87MG细胞对放射治疗的反应过程中,在胶质瘤的放射敏感性调节中起着重要的作用。3.miR-181a和miR-521在U87MG细胞放射处理后明显降低,可作为后期研究目标。第二部分miR-181a、miR-521参与调节脑胶质瘤细胞U87MG放射敏感性的研究目的:检测miR-181a和miR-521对脑胶质瘤细胞U87MG放射敏感性的调节作用。方法:1.合成特异miRNA mimic(miRNA寡核苷酸模拟物),转染人脑胶质瘤细胞U87MG,半定量RT-PCR检测miR-181a和miR-521表达量;2.MTT法分别检测转染miR-181a mimic和miR-521 mimic后U87MG细胞的增殖及对放疗反应的变化;3.软琼脂克隆形成实验检测miR-181a mimic和miR-521 mimic对U87MG细胞克隆形成能力的影响。结果: miR-181a mimic和miR-521 mimic分别转染U87MG细胞后,相应的miRNA表达水平增高。在非放射处理组,转染miR-181a mimic和miR-521 mimic的U87MG细胞较对照组(转染了control mimic)细胞的增殖能力均无明显改变;在放射处理组,转染miR-181a mimic和miR-521 mimic的U87MG细胞均出现生长抑制,但与control mimic组比较,miR-181a mimic组在72小时出现了明显的生长抑制,第4天达到峰值,以后抑制率减小;转染了miR-521 mimic的U87MG细胞与control mimic组比较,也在72小时出现了明显的生长抑制,第4天达到峰值。非放疗处理组软琼脂克隆形成实验中,转染了miR-181a、miR-521及control mimic的3组U87MG细胞间的克隆形成能力无统计学差异。在放射处理组,miR-181amimic、miR-521 mimic均使U87MG细胞的克隆形成能力下降。结论:miR-181a和miR-521能提高胶质瘤细胞U87MG的放射敏感性。第三部分miR-181a和miR-521参与人脑胶质瘤放射敏感性调节的分子机制目的:探讨miR-181a和miR-521参与人脑胶质瘤放射敏感性调节的分子机制。方法:1.生物信息学分析预测miR-181a和miR-521靶基因;2.RT-PCR和western blot检测放射处理前后U87MG细胞中靶基因在mRNA水平和蛋白水平的表达改变;3.构建pre-miR-181a和pre-miR-521真核表达载体,转染U87MG细胞,转染后不同时间点,RT-PCR检测靶基因mRNA水平的改变,western blot检测蛋白水平的变化;4.G418筛选稳定表达真核表达载体的U87MG细胞,流式细胞仪检测稳定表达pre-miR-181a或pre-miR-521的U87MG细胞在放射处理后的凋亡率,平板克隆形成实验检测其克隆形成能力。结果:1.经生物信息学及参考文献综合分析,预测在胶质瘤细胞U87MG中,Bcl-(2B cell lymphoma/lewkmia-2)和CSA(Cockayne syndrome protein A)分别是miR-181a和miR-521的靶基因;2.放射处理后的U87MG细胞,其Bcl-2及CSA的蛋白表达水平均上升,但mRNA水平未见明显改变;3.pre-miR-181a、pre-miR-521真核表达载体转染U87MG细胞后24、48、72小时,Bcl-2和CSA mRNA均未见表达差异,72小时后,Bcl-2和CSA蛋白表达水平均明显下降;4.G418筛选稳定表达pre-miR-181a、pre-miR-521及阴性对照质粒的U87MG细胞,平板克隆形成实验示pre-miR-181a、pre-miR-521阳性细胞较对照组在放射处理后克隆形成能力均明显降低。结论:miR-181a和miR-521分别通过转录后调控,下调Bcl-2和CSA蛋白水平,提高U87MG细胞的放射敏感性。