【摘 要】
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玉米是重要的粮食作物,它在饲料加工及其他工业原料加工方面占有越来越大的比重。因此,玉米的品质直接关系到人类和牲畜的营养健康。玉米籽粒的颜色多种多样且变化复杂,类胡萝卜素是影响玉米籽粒颜色的物质之一。玉米籽粒中含有丰富的类胡萝卜素,如玉米黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、隐黄素、叶黄素等,均是人体所必需的营养元素。所以,鉴定并解析玉米籽粒颜色突变体,发掘类胡萝卜素生物合成途径的关键基因及辅助因子,研
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玉米是重要的粮食作物,它在饲料加工及其他工业原料加工方面占有越来越大的比重。因此,玉米的品质直接关系到人类和牲畜的营养健康。玉米籽粒的颜色多种多样且变化复杂,类胡萝卜素是影响玉米籽粒颜色的物质之一。玉米籽粒中含有丰富的类胡萝卜素,如玉米黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、隐黄素、叶黄素等,均是人体所必需的营养元素。所以,鉴定并解析玉米籽粒颜色突变体,发掘类胡萝卜素生物合成途径的关键基因及辅助因子,研究相关突变体产生的分子机制,对培育高品质玉米具有重大意义。本研究以EMS法得到的白粒突变体wk-15为材料,利用图位克隆方法对突变基因进行定位及克隆,同时对突变体表型及生理生化指标进行分析,并初步研究突变体候选基因功能。取得的研究成果如下:1、通过EMS法诱变得到一种白粒突变体wk-15。（1）表型观察发现:突变体wk-15与野生型RP125对比,籽粒胚乳淀粉层呈现白色。（2）扫描电镜发现:籽粒胚乳细胞中蛋白体、淀粉粒的数量及结构无明显改变,醇溶蛋白含量检测无差异。（3）成熟籽粒粒型测量:野生型与突变体的籽粒表型对比,发现粒长、粒宽呈极显著差异（p＜0.01）,粒厚、百粒重无显著差异（p＞0.05）。（4）不同发育时期籽粒观察发现:突变体wk-15与野生型籽粒颜色差异出现于籽粒授粉后15天时,之后随着籽粒发育颜色差异逐渐显著。（5）成熟期籽粒类胡萝卜素含量检测:突变体wk-15籽粒中的玉米黄素和胡萝卜素含量呈极显著降低（p＜0.01）,野生型中的玉米黄素和胡萝卜素含量分别为30.8μg/g、5.6μg/g;而突变体中仅检测到玉米黄素的含量为3.5μg/g,胡萝卜素未检测到。2、构建B73×wk-15 F2群体,F1代无黄白粒分离,F2群体中分离出白粒性状,经遗传学分析验证,黄白粒分离比符合3:1,证明该突变性状受隐性单基因控制。3、利用B73×wk-15 F2代分离群体进行基因定位:构建BSA显隐性混池筛选多态性标记进行初定位,将区段定位于玉米2号染色体上;以650个隐性单株为材料,以新开发出In Del标记为精细定位标记,将突变基因定位于ind-263与ind-282标记之间,区段大小200 kb。通过对区段内10个候选基因的克隆与分析,将Zm00001d001909基因确认为候选基因。突变体wk-15中,该基因于第五外显子上存在一个单碱基突变,由“G”碱基突变为“A”碱基,氨基酸由色氨酸（Trp）突变为终止密码子;经隐性混池及转录本扩增测序验证,该位点准确且真实存在。对6份相似白粒突变体进行等位检测,发现一份等位突变材料wk-308。4、候选基因Zm00001d001909,基因全长3412 bp,共9个外显子,存在两个转录本,共编码343个氨基酸。该基因编码一个交替氧化酶（AOX）,该酶参与线粒体中的电子传递,暂将其命名为ZmAOX4。经系统进化树分析,该基因在各物种中保守性较高,在水稻、高粱中的同源性高于拟南芥。其编码蛋白经预测,包含一个Ferritinlike结构域,三级结构为二聚体。5、实时荧光定量PCR结果表明,ZmAOX4基因在籽粒形成过程中存在组织特异性表达,于籽粒和苗期叶片中表达量相对较高,突变体wk-15中的表达量明显低于野生型。类胡萝卜素合成途径中关键基因定量结果:与野生型对比,4个基因（PSY1、PDS、ZDS、crt RB1）于突变体中表达存在显著性差异（p＜0.01或p＜0.05）,表达受到影响;其余2个基因LCY-β、LCY-ε在突变体中表达基本无差异（p＞0.05）,表达未受到明显影响。
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