【摘 要】
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目的:长QT综合征（long QT syndrome,LQTS）又称为复极延迟综合征,其以心室复极延长（QT间期延长）为特征、易发生尖端扭转性室速、室颤和心源性猝死的综合征。LQTS包括获得性LQTS和遗传性LQTS。遗传性LQTS的发生率约为1/2500,可由编码或调节心脏钠、钾和钙离子通道的基因突变引起。近年来研究发现,编码钙调蛋白（calmodulin,CaM）的基因（CALM1,CALM2
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目的:长QT综合征（long QT syndrome,LQTS）又称为复极延迟综合征,其以心室复极延长（QT间期延长）为特征、易发生尖端扭转性室速、室颤和心源性猝死的综合征。LQTS包括获得性LQTS和遗传性LQTS。遗传性LQTS的发生率约为1/2500,可由编码或调节心脏钠、钾和钙离子通道的基因突变引起。近年来研究发现,编码钙调蛋白（calmodulin,CaM）的基因（CALM1,CALM2,CALM3）发生突变也可导致LQTS。CaM是一种能与Ca2+结合的多功能蛋白质,其与Ca2+结合后对很多细胞功能、心肌离子通道酶体系和兰尼碱受体（ryanodine receptor 2,Ry R2）等活性都有重要的调节作用。新近的几项研究发现CaM突变体CaMD130G（第130位氨基酸位点由天冬氨酸（D）突变为甘氨酸（G））和CaMN98S（第98位氨基酸位点由天冬氨酸（N）突变为丝氨酸（S））与LQTS的发病相关,然而,这些CaM突变体是如何引起LQTS以及相关的机制,至今仍不清楚。电压门控钠通道1.5（Na V1.5）是心肌细胞中表达的主要钠通道,其由SCN5A基因编码,是心肌细胞电压门控钠通道（Voltage-gated Sodium Channels,VGSC）的主要亚型。研究发现CaM对心肌Na V1.5具有重要调节作用,其可与心肌Na V1.5的IQ基序结合。然而,CaM突变体CaMD130G和CaMN98S是否可与心肌Na V1.5结合以及结合作用是否发生改变,这种改变是否在LQTS的发病中发挥作用,至今也仍不清楚。本课题利用分子对接和GST pull-down技术,对CaM突变体CaMD130G和CaMN98S与心肌Na V1.5钠通道的相互结合作用进行系统而详细的研究,明确两者之间通过直接结合作用的改变而影响通道的功能进而在LQTS的发生中发挥作用,探讨CaMD130G和CaMN98S引起LQTS的发病机制。方法:应用Molercular Operating Environment（MOE）和SWISS-MODEL进行模拟分子对接及其分析,利用Py MOL进行分子可视化,从Pu BMed网站获得目标蛋白氨基酸序列（CaM:Mmdb＿id:99607,Pdb＿id 1:2LL7;IQ:Mmdb＿id:87677,Pdb＿id 1:2L53）。再利用模型编辑软件,预测野生型CaM和突变体CaMD130G、CaMN98S与心肌Na V1.5通道IQ的结合情况。构建野生型CaM和突变体CaMD130G、CaMN98S与心肌Na V1.5通道IQ基序的质粒。采用转染、融合蛋白制备方法制备与纯化野生型CaM和突变体CaMD130G、CaMN98S与心肌Na V1.5通道IQ的蛋白片段。进一步使用Pull-down assay蛋白结合实验方法,检测在不同钙离子浓度情况下,野生型CaM、突变体CaMD130G、CaMN98S与心肌Na V1.5通道IQ基序的结合情况。结果:分子对接结果表明,与野生型CaM相比,突变体CaMD130G和CaMN98S与Ca2+的结合能力下降;同时,突变体CaMD130G和CaMN98S很可能与心肌Na V1.5钠通道的IQ基序结合,但与野生型CaM相比,可能结合作用相对减弱。进一步的GST pull-down蛋白结合实验结果显示,CaMD130G和CaMN98S与Na V1.5钠通道具有结合能力,且结合具有CaM浓度依赖性和Ca2+浓度依赖性。与野生型CaM相比,在Ca2+浓度为2m M和10μM时,CaMD130G、CaMN98S突变体与IQ结合减少,在某些CaM浓度下结合作用具有显著性差异。而在Ca2+浓度为100n M和≈free时,与野生型CaM相比,CaMD130G、CaMN98S突变组与IQ结合未见明显改变。结论:CaM突变体CaMD130G与CaMN98S的突变位点影响了Ca2+的结合,使Ca2+结合量减少。CaM突变体CaMD130G、CaMN98S均可与心肌Na V1.5钠通道的IQ基序结合,且结合作用具有CaM浓度依赖性和Ca2+依赖性。在较高Ca2+浓度下,与野生型CaM相比,突变体CaMD130G和CaMN98S与心肌Na V1.5钠通道的IQ基序结合作用减弱,且在Ca2+浓度为2m M时差异最为明显;在较低Ca2+浓度下,此结合作用无明显差异。
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