原位肝移植术是治疗重型肝炎、肝硬化肝功能失代偿等终末期肝病最有效的治疗手段。随着现代医学技术的发展,肝移植手术的成功率不断提高,术后生存时间不断延长。但是,肝移植术后各种并发症仍然是影响手术成功的一个重要因素,其中术后感染是继移植排异后的另一常见的并发症,发生率约为47%～80%,病死率达13%～36%。肝移植术后感染也是导致移植物慢性失功的重要原因之一,并将增加移植病人住院时间及医疗费用。肝移植术后感染的常见病原体包括细菌(48%)、真菌(22%)、病毒(12%),以术后30天内发生的内源性感染最为常见,约31%的肝移植患者术后至少发生1次由多重耐药细菌引起的感染,约69%的病原菌呈多重耐药。由于肝脏与肠道在解剖结构及功能上有着密切的联系,肠道作为人体最大的贮菌所和内毒素库,在特定条件下可以释放多种毒性物质,导致隐匿的内源性感染。肠道微生态失衡、肠黏膜屏障损伤和肠渗透性增加、免疫功能失调是肝移植感染发生的重要原因。本研究重点是肝硬化大鼠在肝移植前后肠道细菌的分子生态结构以及血清代谢谱的变化规律,旨在探明肝移植后肠道微生态变化与感染的关系,寻找与肝移植相关的特异性代谢靶分子,为进一步探索通过重建、优化肠道微生态,减少肝移植后感染的发生,促进移植受者长期健康存活提供新思路和新途径。本研究首先建立肝硬化大鼠的肝移植模型,继而应用16S rDNA分子微生态研究方法和核磁共振法(~1H NMR),对肠道细菌组成和血清代谢谱变化进行了动态观察,在国内外未见类似的报道。研究方法1.四氯化碳(CCL4)诱导SD大鼠肝硬化模型清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,雌雄各半,体重为180g～200g。分为两组:对照组10只,造模组40只。模型制备方法:对照组大鼠无菌腹腔皮下注射花生油溶液;造模组大鼠无菌腹腔皮下注射40%CCL4花生油溶液。于给药后4周、8周、12周、16周,分别处死2只造模大鼠,取肝,观察肝脏病理进展情况,持续16周复制大鼠肝脏病变模型。造模第16周处死造模组大鼠10只和对照组大鼠5只。剩余的造模组大鼠22只和对照组大鼠5只肝移植备用。2.肝硬化SD大鼠肝移植模型的建立选择清洁级、体重为250g～300g的SD雄性大鼠19只作为供体;从CCL4造模组剩余的22只SD大鼠中,选择体重相近的肝硬化大鼠14只,以及造模对照组剩余的5只SD大鼠作为受体。分为三组:肝硬化肝移植组(正常大鼠一肝硬化大鼠,9只),肝移植对照组(正常大鼠-造模对照组大鼠,5只),假手术组(肝硬化大鼠,5只,只打开腹腔便缝合)。大鼠原位肝移植模型采用经典的Kamada二套袖法。所有的肝移植受体鼠移植前后均不使用抗生素,免疫抑制剂等。3.标本的收集(1)血与粪便:在大鼠CCL4给药前、CCL4给药后4周、肝硬化时/移植前、肝移植术后7天、肝移植术后30天五个时间点,收集所有大鼠的粪便。除CCL4给药后4周外、其他的4个时间点同时采集全血。(2)下腔静脉血、肝、脾、肾组织:在肝硬化/肝移植前(造模组10只、对照组5只)以及肝移植术后30天(所有19只移植受体鼠)两个时间点处死大鼠,收集下腔静脉血、肝、脾、肾组织。4.标本检测方法(1)鲎试验法:检测大鼠血浆内毒素水平。(2)核磁共振法(~1H-NMR):检测大鼠血清代谢谱。(3)细菌需氧与厌氧培养法:取大鼠肝、脾、肾组织,立即研磨,做细菌需氧与厌氧培养及生化鉴定,分析细菌易位发生率及易位细菌种类。(4)细菌荧光定量PCR法:从大鼠粪便抽提总DNA,分别采用肠道六大菌属(肠球菌、肠杆菌、拟杆菌、梭菌、双歧杆菌和乳酸菌)的特异性引物,进行荧光定量PCR检测。(5)聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳指纹图谱(PCR-DGGE)分析:用16SrDNA V3区的通用引物和拟杆菌属、梭菌属和双歧杆菌属特异性引物作PCR-DGGE指纹图谱,对肠道细菌总体变化趋势和以上三种菌属的分子生态结构进行主成分分析并作克隆测序。5.数据统计分析方法计数资料采用t检验,率的统计用χ2检验,采用MATLAB软件进行主成分分析(PCA)。研究结果1.肝硬化SD大鼠肝移植术后细菌易位情况肝移植术后30天,大鼠肝、脾、肾细菌易位率达66%,远高于肝硬化/移植前细菌易位率(10%),两者有统计学差异(P<0.05)。细菌易位部位以肝脏最为常见,脾脏次之,肾脏少见。肝硬化肝移植组的易位细菌种类以粪肠球菌、铜绿假单孢菌、大肠埃希菌为主,而肝硬化/肝移植前的易位细菌种类则以铜绿假单孢菌为主。2.肝硬化SD大鼠肝移植术后肠道细菌的定量变化采用实时荧光定量PCR方法,选择5个时间点(CCL4给药前、给药后4周、肝硬化/肝移植前、肝移植术后7天、肝移植术后30天),动态观察大鼠粪便中六大优势菌的定量变化。结果显示,与肝移植对照组相比,肝硬化肝移植组在肝硬化发展过程中,肠道拟杆菌属、梭菌属、肠杆菌属细菌数量不断下降,肝移植术后细菌数量逐步回升,至肝移植术后30天基本恢复至造模前水平。肠道双歧杆菌属在肝硬化造模过程中菌量升高,但在肝移植术后7天开始显著下降,术后30天部分恢复。肠道乳酸菌属和肠球菌属在肝硬化造模过程中细菌含量改变不明显。3.肝硬化SD大鼠肝移植术后肠道细菌总体分子生态结构变化采用PCR-DGGE方法,借助通用引物,对肠道所有细菌的16S rDNAV3区(可变区)进行扩增,选择4个时间点(CCL4给药前、肝硬化/肝移植前、肝移植术后7天、肝移植术后30天),观察大鼠肠道菌群总体分子生态结构变化。结果发现:(1)组内比较结果显示,CCL4给药前,大鼠肠道细菌的总体分子生态组成差异小,基本聚成一类;肝硬化/肝移植前,肠道细菌的总体分子生态组成差异增大,分布弥散,不能聚成一类;至肝移植术后30天,肠道细菌的总体分子生态组成差异减小。(2)组间比较结果显示,肝移植术后30天组与CCL4给药前组相比差异最大,但与肝移植术后7天组相比差异不明显。4.肝硬化SD大鼠肝移植术后肠道拟杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属的分子生态结构变化应用类群特异性PCR-DGGE方法,进一步观察肠道各优势菌属(拟杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属)在4个时间点(CCL4给药前、肝硬化/肝移植前、肝移植术后7天、肝移植术后30天)的分子生态结构变化,结果发现:(1)组内比较结果显示,CCL4给药前,大鼠肠道拟杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属的组内分子生态组成均相似,基本上均聚成一类;CCL4给药后,上述各菌属的组内分子生态组成差异均增大,分布弥散。(2)组间比较结果显示,拟杆菌属肝硬化/肝移植前组、肝移植术后术后7天、肝移植术后术后30天组与CCL4给药前组相比差异均明显,特别是术后30天组最为显著,而术后7天组与肝硬化/肝移植前组的距离较近;梭菌属肝硬化/肝移植前组、肝移植术后30天组与CCL4给药前组相比差异均明显,特别是术后30天组,而在术后7天组基本恢复到CCL4给药前组水平;双歧杆菌属肝硬化/肝移植前组与CCL4给药前组相比差异明显,分子生态结构不能聚类,分布在各个象限,但术后7天组与术后30天组相比,能聚集在一起,提示在肝移植术后,肠道双歧杆菌属的组成能较快恢复稳定。5.肝硬化SD大鼠肝移植术后血清代谢谱的变化应用核磁共振法(~1H-NMR),结合多元统计分析,选择4个时间点(CCL4给药前、肝硬化/肝移植前、肝移植术后7天、肝移植术后30天),动态观察22只大鼠的血清代谢谱(18种物质)变化。结果显示,大鼠肝硬化/肝移植前,血清乳酸、高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、甜菜碱明显上升,而谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白、葡萄糖、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂肪酸、乙酸出现下降。随着供肝的植入,大鼠血清代谢物的异常逐渐消失,代谢物恢复正常所需的时间各不相同。用主成分分析(PCA)发现,CCL4给药前组、肝硬化/肝移植前组、肝移植术后7天组的血清代谢谱完全分离,分布在不同的区域,说明它们的代谢谱完全不同,但肝移植术后30天组与CCL4给药前组的血清代谢谱有部分重叠,提示此时的代谢谱已有部分恢复。结论本研究采用系统生物学方法,对SD大鼠肝硬化前后、肝移植前后不同时间点肠道细菌的分子生态组成及血清代谢谱进行动态观察,证实大鼠肝移植术后存在肠道菌群与血清代谢失衡,发现了肠道六大类优势菌属及血清代谢谱的变化规律与变迁模式,为下一步寻找功能菌以及用微生态制剂(包括益生菌等)恢复正常菌群结构、保护肠黏膜屏障、减少细菌易位和移植感染的发生提供了一个创新的思路。