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目的:本实验研究奥美拉唑对人肺腺癌细胞A549体外增殖、生长作用,并探讨其可能的作用机制。
方法:选用A549为研究对象,常规体外培养人肺腺癌细胞A549,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法检测OME不同浓度组(1、10、50、100、200ug/ml)、不同时间组(24、48、72h)对细胞存活和生长的影响,从而选择适当的药物浓度及作用时间。根据MTT结果,设置OME不同浓度组(0、50、100 ug/ml),作用48h进行后续实验。光学显微镜观察细胞形态学改变。流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定OME对A549细胞周期分布和凋亡的影响。采用流式细胞仪间接免疫荧光技术半定量检测OME处理细胞48h后bcl-2、survivin蛋白的表达水平。分别提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性及含量,通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)半定量检测OME处理前后A549细胞中bcl-2、survivin mRNA的表达水平。
结果:MTT比色法显示OME(1、10、50、100、200 ug/ml)对人肺腺癌细胞A549细胞增殖具有抑制作用(p<0.01)。不同浓度奥美拉唑组中,在1ug/ml和10ug/mlOME处理细胞组间未见剂量依赖效应(p>0.05),余浓度处理组随奥美拉唑处理浓度的增大,A549细胞的抑制值逐渐增大,其增殖抑制作用显示出明显的剂量依赖效应,但其抑制值与时间未见明显时间依赖效应。光镜下观察细胞形态结果显示:未经药物作用的细胞呈多形性或梭形,形态饱满,而用药组中50ug/ml OME处理细胞组细胞数目减少,体积缩小,细胞核固缩,胞体折光性减弱,胞浆内可见有颗粒。100ug/mlOME处理细胞组细胞数目明显减少,体积变大,胞体失去折光性,大部分细胞脱壁,部分细胞胀大破裂。流式细胞仪检测细胞周期分布显示,0、50、100ug/ml OME作用A549细胞48h后,随药物浓度增大,G1期细胞逐渐增多,S期细胞逐渐减少,G2期细胞变化不明显。即OME可阻滞A549细胞周期进程于G1期,该作用呈剂量一效应依赖关系。0、50、100ug/mlOME处理细胞48h后,流式细胞仪未测得典型的亚二倍体凋亡峰,依OME浓度逐渐增大,凋亡百分率分别为:0.53％、0.57％、1.47％。流式细胞仪间接分析细胞bcl-2和survivin蛋白表达显示,0、50、100ug/ml OME处理A549细胞48h后,bcl-2的荧光指数FI值均较对照组FI值减小,但处理组间出现随OME浓度的增大,出现bcl-2的FI值减少后再次升高；survivin的荧光指数FI值随处理浓度增大而逐渐减小。对于每一种蛋白,比较其处理组和对照组的FI值,差异均极具有显著性(P<0.01)。半定量RT-PCR检测结果显示:OME处理前A549细胞bcl-2和survivin基因均表达阳性。与对照组相比,经50ug/ml OME处理的A549细胞中bcl-2 mRNA表达无明显变化,无显著性差异(P>0.05)；100ug/ml OME处理A549细胞中bcl-2 mRNA表达明显增多,差异极具有显著性(P<0.01)。与对照组相比及处理组间均显示Survivin mRNA表达明显降低,差异均极具有显著性(P<0.01)。
结论:1、本实验证明OME对人肺腺癌A549细胞有明显的抑制增殖作用,为临床肺癌的治疗提供了新的思路和理论依据。2、本实验表明OME抑制A549细胞增殖的作用呈剂量依赖关系,未显示出明显的时间依赖关系。3、本实验证明OME可阻滞A549细胞于G0/G1期,抑制细胞生长。4、一定浓度的OME能够在mRNA转录水平和蛋白水平降低survivin的表达。初步推论OME通过下调survivin mRNA转录、蛋白的表达而在体外发挥其抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导凋亡的作用。5、本实验显示在高浓度OME前提下,未降低bcl-2mRNA和蛋白表达。