目的：为了进一步增强膀胱癌组织特异性溶瘤腺病毒基因治疗的有效性,可以将肿瘤微环境作为靶点进行研究,有研究表明,细胞内外微环境的改变可以影响腺病毒载体的复制和凋亡相关蛋白的表达,同时在腺病毒侵染细胞的过程中,细胞会应激产生超氧阴离子O2,由于活性氧自由基中O2可作为一种第二信使分子参与细胞信号通路调控基因的表达,能改变细胞内氧化应激状态,从而调节细胞生长、增殖及凋亡过程,所以本研究观察在重组溶瘤腺病毒Ad/UPII/E1A转染膀胱肿瘤细胞的过程中,施加外源的O2,探讨O2对膀胱癌特异性溶瘤腺病毒基因治疗肿瘤中的作用及其可能机理。方法：培养膀胱肿瘤细胞株EJ和5637,以黄嘌呤氧化酶-黄嘌呤(XO-X)反应系统作为O2的供体,应用NAC和DDC分别作为内源性O2的清除剂和超氧化物歧化酶(SOD)的抑制剂,采用MTT法检测O2对重组病毒抗肿瘤作用的影响；显微照相观察O2和重组溶瘤腺病毒作用膀胱肿瘤细胞后出现的细胞病变效应(CPE)；透射电镜观察腺病毒颗粒进入细胞的情况和亚细胞结构变化；蛋白印迹法分别检测CAR的表达及MAPK通路关键激酶P38、 ERK、 JNK的磷酸化激活水平；应用流式细胞术检测q或重组溶瘤腺病毒作用肿瘤细胞后的细胞周期分布和凋亡情况。采用SigmaPlot11.0和SPSS17.0软件通过Student t检验和方差分析对数据进行统计学处理。结果：重组腺病毒Ad/UPII/E1A具有较高的纯度和滴度,并能通过E1A基因发挥溶瘤作用。MTT法测体外细胞毒实验发现,低浓度O2单独作用或还原胁迫条件能够促进膀胱肿瘤细胞的增殖,而中,高浓度O2或氧胁迫条件则有效增强了腺病毒对膀胱癌细胞的抗增殖能力,并呈剂量、时间依赖性。显微镜下观察膀胱特异性溶瘤腺病毒感染膀胱肿瘤细胞株EJ和5637后,肿瘤细胞出现了明显的细胞病变CPE效应。透射电镜观察发现,O2能够促进重组溶瘤腺病毒大量进入膀胱肿瘤细胞,并引起肿瘤细胞自吞噬和凋亡。流式细胞术结果表明O2或腺病毒单独作用时,膀胱肿瘤细胞出现G1期阻滞,联合作用后能够使肿瘤细胞的细胞周期阻滞于S期,出现明显的凋亡峰。而且O2单独作用时膀胱肿瘤细胞早期凋亡较多,联合作用后肿瘤细胞晚期凋亡增多。蛋白免疫印迹实验发现,在EJ细胞中,给予外源性的O2能上调受体CAR的蛋白表达量,有效的促进了腺病毒转染进入肿瘤细胞内,且这种作用具有细胞差异性。通过检测MAPK信号通路关键激酶如JNK、 ERK、 P38的磷酸化水平,发现与腺病毒单独作用组相比,O2与病毒联合组,随O2浓度的增大,ERK和p38的磷酸化水平逐渐增高,而JNK的磷酸化水平变化没有明显差异,提示O2对重组病毒基因治疗膀胱肿瘤细胞的作用机理可能与MAPK信号通路有关。结论：研究结果表明,通过调节肿瘤细胞内外微环境,外源性O2或通过DDC产生的氧胁迫都能发挥调控病毒基因治疗膀胱肿瘤的作用,自由基超氧阴离子增强了腺病毒对膀胱癌细胞的抗增殖能力,其机理可能与细胞周期S期阻滞以及细胞凋亡有关,而MAPK信号通路参与了q对溶瘤腺病毒治疗膀胱肿瘤的调控作用。通过应用一定剂量的O2会提高溶瘤腺病毒治疗膀胱肿瘤的有效性,为自由基生物治疗的临床应用提供了理论根据。