登革病毒（dengue virus)属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链的 RNA病毒，全长约11kb，含有一个单一的开放读码框，开放读码框可依次编码3种结构蛋白（C、PrM和E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。结构蛋白主要参与病毒与宿主细胞的吸附及病毒颗粒的组装；其中E蛋白是对病毒感染起保护性免疫作用的抗原。非结构蛋白则主要在病毒基因组的复制和翻译过程中发挥重要作用[1]。登革病毒（dengue virus，DEN）包括4个血清型（DENV-1型，DENV-2型，DENV-3型，DENV-4型），其引起的登革热是世界上分布最广、发病人数最多、危害最严重的蚊媒疾病，广泛流行于全球100多个国家[2]。由其感染所引起的疾病包括：无症状感染、一般性发热、温和的登革热（dengue fever，DF）以及严重的登革出血热（dengue hemorrhagic fever， DHF）和登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）[3]。接种疫苗是控制登革热最重要的手段。由于抗体依赖增强感染效应(Antibody-dependent enhancement,ADE)，理想的登革疫苗应该是能够诱导人体产生4种血清型 DENV均有免疫保护作用[4-6]。　　进展最快的登革疫苗是法国赛诺菲巴斯德公司的登革四价减毒活疫苗（ CYD-TDV），该疫苗已经完成三期临床试验，于2016年1月份在墨西哥率先上市,临床数据显示，该疫苗抵抗DENV-1、DENV-3、DENV-4的有效率分别为50.3％、74.0%、77.7%，但抗DENV-2的有效率只有42.3%[7,8]。该嵌合疫苗是以黄病毒家族（YF-17D）毒株骨架，再以4个血清型DENV病毒的同源序列（prM-E）替换骨架病毒的相应基因得到的重组嵌合毒株，从而获得合适的减毒效率和较强的免疫原性[9,10]。　　我国研制的乙脑减毒活疫苗 SA14-14-2于1989年在中国被批准上市，目前为止，已经有超过3亿儿童接种疫苗。研究显示，该疫苗株具有良好的减毒特性和安全性，单次免疫能有效诱导产生保护性的中和抗体，而且免疫力持久[11-13]。由于黄病毒的基因机构、复制翻译策略都非常相似，可以用分子生物学的方法相互改变黄病毒的基因，以构建新的嵌合病毒[14-16]。李晓峰等[17]将DENV2的PreM-E蛋白基因成功插入SA-14-14-2为骨架中，构建了ChinDENV2型嵌合疫苗，该嵌合病毒在小鼠和灵长类动物上具有减毒效果。本研究拟以乙脑减毒活疫苗SA14-14-2为骨架，将登革4型病毒PreME蛋白编码基因替换进SA14-14-2基因中，继续构建DENV4型嵌合疫苗，初步完成乙脑/登革4型嵌合病毒的构建与生物学性质评价。　　本研究包括以下两个部分：　　一、乙脑/登革4型嵌合病毒的构建。　　嵌合病毒是利用反向遗传学的方法，由结构功能相似的同源或者异源病毒相互替换部分结构基因而获得的一种新的病毒，为了保证重组病毒的安全性，我们一般采用已知特性的病毒株，一般多选用减毒株作为病毒载体。本研究利用乙脑减毒活疫苗 SA14-14-2为骨架，我们采用分子生物学的方法将疫苗株的PrM和E蛋白编码基因替换为登革4型病毒（DENV4-GZ30）的PrM和E蛋白的相应部分，构成一种新的嵌合质粒，命名为pChinDENV4。　　通过酶切图谱初步确定嵌合质粒的大小和完整性,进一步测定质粒的全基因序列,运用 DNA STAR软件比对嵌合质粒与病毒基因序列的差异。利用体外转录的方法，将嵌合质粒转录成RNA，并且转染BHK-21细胞，约3天后细胞出现典型病变后，得到嵌合病毒。通过反转录PCR实验判断病毒是否正确。测病毒cDNA序列，比对是否与原质粒序列相同。　　实验结果表明，我们能通过反向遗传学的方法成功拯救出乙脑/登革4型嵌合病毒。嵌合病毒能够在BHK-21细胞上复制。　　二、乙脑/登革4型嵌合病毒生物学特性评价。　　我们对嵌合病毒与其亲本病毒在不同细胞系中的生长特性进行测定，结果发现其与亲本病毒株相比无显著差异。进一步对嵌合病毒的蚀斑特征及在动物体内的神经毒力和神经侵袭力进行了测定，结果显示嵌合病毒的蚀斑大小介于两亲本株之间，其神经毒力和神经侵袭力与亲本株弱。　　综上，本研究采用反向遗传学的方法，构建了一种新的登革乙脑嵌合病毒，通过将嵌合病毒与其亲本病毒株生物学特性鉴定和比较，我们发现嵌合病毒在细胞上的复制生长能力没有降低，但毒力较其亲本病毒株减弱，乙型/登革病毒反向遗传学系统的建立为基因乙脑疫苗株骨架的新型登革病毒四价疫苗的研制奠定了基础。