SDR调控拟南芥盐和干旱胁迫反应及其互作蛋白筛选

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泛素/26S蛋白酶体是植物降解蛋白质的重要途径,而被降解底物的专一性由E3泛素连接酶决定,它可以将泛素转移到底物上。F-box蛋白是泛素降解途径中E3泛素连接酶SCF复合体(Skp1-Cullin/CDC53-F-box)的一个亚基。它不但调控植物生长发育,而且可以影响植物对逆境胁迫的响应。本文鉴定了拟南芥F-box蛋白At5g1 5710(这里命名为Salt and Drought Response,SDR)的功能。通过生物信息学分析发现SDR上游启动子区域存在大量的非生物胁迫响应元件,包括脱落酸响应元件,热激响应元件,干旱响应元件,病虫害和盐胁迫响应元件,干旱和冷害响应元件等。然后,通过qRT-PCR的方法分析了SDR在逆境胁迫下的表达反应。结果显示,SDR可以被ABA、热激和盐的诱导表达,而在干旱处理下表达受到抑制。并且SDR在植物中各个时期都有表达,在莲座叶和花器官中表达量相对较高。说明SDR可能参与了植物对非生物胁迫的响应。为了进一步研究SDR的功能,本文中克隆了SDR的基因全长,构建了35S::SDR过表达载体和35S::AntiSDR反义载体,并通过筛选得到T3转基因株系纯合体。为了研究SDR蛋白亚细胞定位,还构建了SDR融合eGFP载体(35S::SDR+eGFP)。通过在洋葱表皮细胞的瞬时表达,发现SDR蛋白定位于细胞核中。转基因材料35S::SDR植株对盐胁迫不敏感,而35S::AntiSDR植株对盐胁迫敏感,主要表现在萌发率,子夜变绿和主根长等生理指标上。在成年阶段35S:5SDR植株对干旱胁迫敏感,相反,35S::AntiSDR植株对干旱胁迫不敏感。另外,进一步通过RT-PCR的方法检测了35S::SDR植株中盐胁迫和干旱胁迫相关基因的表达,发现HKT1、RD29A、COR15B、KIN1表达下降,P5CS1表达量上升。以上研究说明SDR参与了植物对盐胁迫和干旱胁迫反应的调节。为了更深入的了解SDR调节盐胁迫和干旱胁迫的下游通路,本实验还通过酵母双杂交的方法,寻找SDR下游的靶蛋白。通过筛选鉴定,得到34个阳性克隆,其中有11个克隆测序同为一个基因CCoAOMT1。酵母回补实验后最终得到八个候选蛋白(VAB3、IPMI2、IPMI SSU1、FVE/ACG1、CCoAOMT1、MORF、Cytochrome c oxidase、AT3G10270)。但目前仍没有确定其靶蛋白,后续实验正在研究中。
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