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废烟叶提取液(tobacco waste extract,简称TWE),是再造烟叶生产工艺中最主要的原料,是尼古丁的水体排放形式,也是现代烟草生产工业中尼古丁污染的直接来源。废烟叶提取液的醇化处理是再造烟叶生产工艺中的重要环节,可以明显提高再造烟叶的品质,且微生物在此过程可能发挥了重要的作用。国内外关于废烟叶提取液醇化过程中微生物多样性的研究鲜有报道。本研究首先利用MiSeq高通量测序技术对TWE浓缩液醇化过程中微生物多样性进行了分析。各个样品中,乳杆菌属(Lactobacillus)是最主要的细菌优势菌,而能够耐受高糖浓度的假丝酵母(Candida)成为了最主要的真菌优势菌。此外,能够耐受恶劣环境的芽孢杆菌属(Bacillus)和能够利用尼古丁的假单胞菌属(Pseudomonas)在5天的醇化处理过程中明显增多。因此醇化处理对于TWE浓缩液中微生物的群落结构多样性有着重要的影响。随后,从TWE浓缩液样品中筛选分离得到多株具有增香或尼古丁降解功能的微生物,并对其中一株增香效果较好的菌株进行菌种鉴定,确定了该菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并将其命名为Bacillus subtilis SM。考察了其在TWE浓缩液中的增香效果,并在2 m~3工业生化反应罐中进行应用试验,达到了改善烟草薄片口感的效果。同时对一株从TWE样品中筛选得到的具有最强尼古丁降解能力的菌株Pseudomonas sp.JY-Q进行了TWE中的尼古丁降解条件优化,且将该菌应用于再造烟叶生产工艺中尼古丁降解研究。通过条件优化,Pseudomonas sp.JY-Q在30 L发酵罐中可在9小时内完全降解10%TWE中约1.5 g/L的尼古丁。在2 m~3工业生化反应罐中进行100L 10%TWE的降解试验,在30℃、45 rpm/min的条件下,经过24小时发酵,Pseudomonas sp.JY-Q对其中尼古丁的降解率达到了17%,尼古丁降解量达到了25 g。最后,本研究尝试利用Red同源重组技术对Pseudomonas sp.JY-Q的糖代谢途径进行敲除,以期减少TWE中糖的存在对尼古丁降解的影响。主要尝试对糖代谢的关键酶基因葡萄糖激酶基因进行了敲除,结果显示kana基因已经重组到了Pseudomonas sp.JY-Q的基因组,但未能完成对葡萄糖激酶的定点敲除,这可能是由于所设计的同源臂偏短导致了重组位点的偏移。提示后续研究中可通过设计合适的同源臂来提高同源重组的专一性以完成对葡萄糖激酶的敲除。