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目的:肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中肝细胞癌(HCC)是肝癌中最常见的一种组织病理学类型,约占90%以上。在人类常见肿瘤中,HCC的发病率在全世界范围内排第六位,而每年死于肝癌的患者数在全世界为癌症的第三位,并且发病率和死亡率居高不下。据全球癌症统计数据公布,在2012年全世界新增肝癌患者782500例,死亡745500例。令人惊悚的是,全球将近一半的新发病例与死亡病例都在中国。由于医疗卫生条件的不断改善,我国肝癌的死亡率在两性中都呈下降趋势(2000-2011)。但中国人口基数大,肝癌患者数量依然庞大。肝细胞癌在我国仍是占据发病率第四位、死亡率第二位的恶性肿瘤。肝癌具有病情隐匿、治愈率低、预后凶险等临床特征。在我国男性比女性高发,60岁以下男性中,肝癌是最常见和死亡率最高的恶性肿瘤。因此,对肝癌细胞增殖凋亡、侵袭迁移的实验研究不仅有重要的理论意义,还具有科研和临床应用价值。Wnt7a蛋白是19个Wnt蛋白家族中的成员之一,它在神经与肌肉发育,器官功能的维持方面发挥着不可替代的作用。与其它Wnt蛋白相比,Wnt7a基因只有一个转录本,包含4个外显子。此外,Wnt7a基因序列还包含一个CpG岛和两个CpGrich序列,且第一个外显子位于CpG岛中,极可能发生甲基化。这与肿瘤的发生有紧密联系。Wnt7a在各种肿瘤组织或细胞中的表达也有很大差异。一些研究发现Wnt7a在肿瘤中的低表达是由甲基化引起的。而该蛋白在肝癌中的作用仍不清楚。本课题旨在探讨Wnt7a在HCC组织及细胞系中的表达,分析其与患者临床病例特征的关系,探究其临床意义;进一步深入探究Wnt7a对肝细胞癌进展的作用及其相关分子机制,以阐明Wnt7a在肝癌诊断、治疗及预后过程中的应用价值。研究方法:1标本收集收集2013年1月到2015年1月手术切除肝细胞癌组织标本33例,包括癌组织及其对应癌旁组织。实验室冻存肝癌细胞系4株(HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh-7)。2数据库分析WNT7A mRNA在肝癌中的表达及其临床预后关系运用Oncomine数据库分析WNT7A mRNA在正常肝组织及肝癌组织中的表达情况;运用www.kmplot.com分析WNT7A mRNA表达与预后生存的关系。3检测Wnt7a在肝癌组织及细胞系中的表达(1)应用免疫组织化学方法检测Wnt7a蛋白在33例肝癌组织及其对应癌旁组织中的表达。(2)采用蛋白质印迹方法检测肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh-7中Wnt7a蛋白表达水平,并筛选出相应细胞系进行后续实验。4 Wnt7a与肝癌细胞增殖凋亡、迁移侵袭等生物学特性研究对Wnt7a低表达的细胞系Hep3B转染WNT7A过表达质粒或rWnt7a处理,采用MTT实验、transwell实验、流式细胞术分别检测增殖、迁移侵袭及凋亡的影响。5 Wnt7a导致HCC生物学特性改变的机制研究采用蛋白质印迹及免疫荧光检测肝癌细胞系Hep3B过表达WNT7A后凋亡、增殖、EMT相关基因表达水平以及SKP2/P21通路的改变。结果:1肝癌组织中的WNT7A mRNA表达水平低于正常肝组织。WNT7A低表达的肝癌患者其生存率较高表达组低。肝细胞癌癌组织中Wnt7a蛋白表达水平明显低于癌旁组织。Wnt7a蛋白在Hep3B细胞中几乎不表达,而在其他三种细胞(SMMC-7721、HepG2、Huh-7)呈微弱的表达。2过表达WNT7A后,Hep3B细胞增殖凋亡增加。rWnt7a能降低迁移侵袭能力。3过表达WNT7A后,Hep3B Cleaved-Caspase-3表达升高,E-cadherin表达升高而N-cadherin表达下降。Wnt7a抑制肝癌并非通过Wnt/β-catenin通路起作用,而是失活SKP2从而上调抑癌基因P21。结论:1 Wnt7a在肝癌组织中表达减弱,其异常表达可能与肝癌的侵袭转移有关。2 Wnt7a能抑制EMT进程从而抑制肝癌细胞的迁移侵袭并通过上调Caspase-3活性促进凋亡。另外,Wnt7a能使SKP2失活进而上调P21,起到抑癌的作用。