原位组织再生修复生物材料基于细胞分子水平,要求生物材料表面与细胞产生特定的应答反应,诱导细胞增殖、分化以及细胞外基质的合成与组装。微生物合成的聚羟基烷酸酯具有良好的生物相容性、生物可降解性和压电性等,但强疏水性及化学惰性使其不具备原位组织修复的功能。为构建细胞相容且具引导软骨组织再生功能的表面,本研究提出了PHBV材料表面改性技术,分步得到含有酰胺基、胺基和胶原的PHBV膜。同时采用紫外光接枝聚合技术得到了表面接枝聚丙烯酰胺的结构模型及聚丙烯酰胺与PHBV半互穿网络的结构模型,并利用后者首次实现了PHBV支架内表面酰胺化的构建。该支架复合绵羊BMSCs体外诱导成软骨分化,实现了半月板无血运区损伤的修复。 采用引发剂预浸的紫外光接枝聚合技术,制备了新型的酰胺化PHBV膜。通过合理调控单体浓度和照射时间获得了具有表面接枝层或接枝链与PHBV膜基体形成半互穿网络的两种结构模型,并提出了紫外接枝聚合过程及反应的机理。酰胺基的引入不但为PHBV膜提供了进一步反应的位点,还使其亲水性明显提高。接枝的聚丙烯酰胺链会楔入PHBV球晶的晶片间,原位与PHBV链交缠,导致晶面间距的增大。一旦大量的接枝链进入晶片间,接枝链可能会使PHBV晶片发生分离甚至剥离。接枝链的引入使PHBV的结晶度降低、熔点降低及重结晶能力降低。酰胺化PHBV膜在230℃以下具有较好的热稳定性,体外水解明显加快。 利用接枝链与PHBV基体的半互穿网络结构模型实现了PHBV支架内表面的酰胺化改性。聚丙烯酰胺的链转移反应是形成这一结构的原因。酰胺化改性使PHBV支架的孔隙率降低,密度增加,孔径以40 μm左右的小孔为主。亲水性的半互穿网络结构赋予PHBV支架良好的压缩性能,其功能化的表面还利于水溶性生长因子等蛋白质的吸附。 通过绵羊BMSCs细胞粘附、细胞-材料形貌观察、增殖指数、细胞内DNA及蛋白质含量等一系列实验,证明酰胺化PHBV支架有利于细胞的早期粘附,促进细胞铺展、细胞间粘连及基质的分泌。在此基础上以酰胺化PHBV支架体外构建组织工程化半月板,以TGF-β及IGF-1联合诱导BMSCs向成软骨分化。培养后的细胞-支架复合物行扫描电镜观察、番红O和阿利新蓝染色、II型胶原免疫组化染色及细胞内GAG含量测定等实验。细胞由原来成纤维细胞样的长梭形向软骨细胞样的扁平形、圆形转化,复合物具备软骨组织分泌蛋白多糖和II型胶原的特征性。 采用体外构建的软骨样组织修复半月板无血运区损伤,并研究酰胺化PHBV支架引导软骨组织再生的功能。植入绵羊半月板损伤处前,体外构建的软骨样组织先行埋植于动物皮下4周,待周围形成肉芽组织包裹后再植入膝关节内半月板损伤处。同时设置了半月板损伤后不处理、单纯植入支架和直接植入体外构建的软骨样组织作为对照组。预先皮下埋植的试验组,不但实现了半月板损伤的修复,而且明显减轻了支架材料对关节软骨的磨损。酰胺化PHBV支架可应用于半月板修复的组织工程。 以酰胺化PHBV膜为基材,采用Hofmann降解反应实现功能基的转化,制备了胺基-酰胺化PHBV膜,保留了表面接枝层或半互穿网络两种结构。部分胺基化的聚丙烯酰胺链降低了PHBV的熔点,明显抑制了PHBV的重结晶,PHBV球晶的不完善性显著增加。胺基-酰胺化PHBV膜具有较好的亲水性和保水性,在200℃以下未发生较为明显的热失重。体外水解时,接枝率为6～33％胺基-酰胺化PHBV膜的失重率随降解时间延长呈上升趋势,降解液的pH值基本稳定在7.1左右；接枝率超过53％时,膜失重率呈先升后降的趋势。在降解最初的30～50天出现最大的失重率,该阶段降解液pH值在7.0～8.5范围内变化,降解360天时基本稳定在7.2～7.4。 采用甲醛活化胺基-酰胺化PHBV膜后接枝胶原,制备了胶原-酰胺化PHBV膜,同时保留了表面接枝层或半互穿网络两种结构。胶原-酰胺化PHBV膜在70℃左右出现了熔限较宽的胶原变性及反应过程形成的PHBV不完善球晶的熔融峰,110℃以上发生明显热失重。该膜的亲水性得到改善,体外水解期间降解液的pH值稳定在6.9～7.3的范围,膜失重率随降解时间延长呈上升趋势。 以表面酰胺化、胺基-酰胺化及胶原-酰胺化PHBV膜为模型,进行了软骨细胞相容性研究。三种功能化的表面均不同程度地促进了软骨细胞的粘附、增殖及生长。PHBV膜表面的酰胺化及胶原-酰胺化明显提高了细胞的早期粘附。胺基-酰胺化PHBV膜过度亲水的表面不利于改善细胞的早期粘附。在接种3～5 d,胶原-酰胺化PHBV膜明显比其余两种功能化表面更利于细胞的增殖和细胞活力的提高。 紫外接枝聚合技术为组织再生修复支架材料内表面功能化的构建提供了一种新方法。该法结合了PHBV支架的框架结构及接枝链的“类水凝胶”结构,赋予改性支架新的功能。胺基及胶原功能基的引入,开启了材料表面功能化多样性设计的探索。