NCAMs对脊髓损伤的修复作用及构建pcDNA4/myc-NCAM140转染BMSCs的实验研究

来源 :昆明医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jybertrand123
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本研究首先通过改良的NYU Weight-Drop Impactor(NYU Spinal Cord Contusion System)制作的脊髓撞击伤模型,于不同时间点取出脊髓,并对其行神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)免疫荧光染色和westem blot蛋白定量检测,探讨NCAM在SCI后的分布和表达变化规律;通过建立脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后随即于蛛网膜下腔埋管,实现局部定期给予rhNCAM1/CD56蛋白,并通过对脊髓残留面积测量、行为学检测BBB评分、HE染色和NF200、GFAP免疫荧光染色等手段,观察rhNCAM1对损伤脊髓的神经保护和促再生作用。结果表明:SCI后,NCAMs在SCI后的不同节段和不同时间段均有明显的动态变化过程,提示NCAM可能参与脊髓可塑性;SCI后随即蛛网膜下腔局部定期给予rhNCAM1后,脊髓残留组织明显增加,后肢功能得到明显的恢复,NF200和GFAP的表达量增加,提示NCAM对SCI有神经保护和促再生作用。在已获得NCAM对损伤脊髓有保护作用的基础上,本研究进一步构建NCAM基因并转染骨髓基质干细胞(bone marrow storm cell,BMSC),拟为今后NCAM治疗SCI提供有用的基因工程细胞。为此,本实验进一步通过RT-PCR从小鼠大脑组织提取的总RNA中,扩增出NCAM140 cDNA,并将其亚克隆入pcDNA4/myc质粒中,体外构建NCAM140基因重组质粒;利用脂质体转染的方法,将其转染并用Zeocin筛选稳定大量表达NCAM140的BMSCs,用western blot检测转染后不同时间段NCAM和标记基因myc的表达情况。结果显示:从小鼠大脑组织的RNA中扩增出NCAM140cDNA,并将其亚克隆入质粒载体pcDNA4/myc中,经酶切和基因测序表明,成功构建了重组质粒载体pcDNA4/myc-NCAM140;将其转染至体外培养的BMSCs,western blot检测表明:转染了pcDNA4/myc-NCAM140的BMSCs在不同时间段均有NCAM和标记基因myc的大量表达,并用Zeocin筛选出稳定大量表达NCAM140的BMSCs。本研究一方面探讨了NCAMs在SCI后的表达变化规律,并进一步探讨了SCI后局部给于rhNCAM,发现其对SCI有明显的修复促进作用;另一方面成功构建了高表达NCAM的BMSCs,从而为转基因干细胞移植治疗SCI提供了一个新的思路。
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