花色（flower color）是指显花植物的整个生殖器官的颜色,狭义是指花辦的颜色,广义是指花器官花萼、雄蕊甚至苞片发育成花辦的颜色。花色素主要由类胡萝卜素（carotenoids）、类黄酮（flavonoids）、生物碱（alkaloids）三类物质所组成,其中类黄酮类物质具有产生蓝色的效果。在类黄酮类物质的代谢中,F3’5’H基因（即蓝色基因）编码关键酶,决定无色二氢黄酮醇的羟化位置和程度,能使花色素苷生物合成途径趋向于产生蓝色的翠雀素-3-葡糖苷,从而使花趋向于蓝色。虽然自然界中的花色种类繁多,但是蓝色和紫色系的重要花卉,如玫瑰、康乃馨、郁金香等却十分有限。采用基因工程能有目的地改良植株,并通过目测或少量辅助手段即可判定改良效果。因此,本论文选用了F3’5’H基因为目的基因,以模式植物烟草为材料,研究了转F3’5’H基因烟草花色的改变。论文研究内容与结果如下: 1.F3’5’H基因正向植物表达载体的构建及农杆菌菌株的转化 用Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切含目的基因的克隆载体p^{UCm-F3’5’H}和表达载体质粒p^BinAR,回收、连接目的片段与载体,构建成正向植物表达载体p^{BinF3’5’H}。将p^{BinF3’5’H}转入农杆菌LBA4404,经检测,得到含有F3’5’H基因的农杆菌LBA^F3’5’H。 2.根癌农杆菌介导的F3’5’H基因对烟草的遗传转化 切取大小为5×5mm²的烟草无菌苗叶片,以OD₆₀₀=0.2的农杆菌LBA^F3’5’H菌液感染15min,用液体培养基MS0振荡脱菌2h。无菌水冲洗5次后,即用无菌滤纸吸干水分,然后接入培养基MS1上暗培养3-6d,再转入培养基MS2上进行筛选分化培养。待培养基MS2上生长的芽长到长约1cm后,将其切下接入培养基MS3中进行生根筛选,筛选出能够正常生根的烟草苗并做进一步的鉴定。 3.转化植株的PCR鉴定和转基因植株花色素苷含量的测定 根据已知编码矮牵牛F3’5’H基因的Hfl位点设计特异引物,对转化植株进行PCR检测。筛选得到20株阳性植株,所得转化株系命名为Y^F3’5’H,未转化的烟草对照用Y⁰表示。 对PCR检测结果阳性,且花色发生明显变化的Y^F3’5’H,各选取其不同花发育时期的花为材料,用Y⁰为对照,提取花中的花色素苷,用比色法测量其相对含量。结果表明,在花器官发育的各个时期,Y^F3’5’H的花色素苷含量均比Y⁰高,其中第4、5期时比Y⁰高约2.3倍和2.4