类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为特征的慢性自身免疫性炎症性疾病,可导致软骨和骨的破坏,功能受限和残疾。依那西普(Etanercept)是首个获准在RA中使用的生物制剂,能够减轻疾病体征和症状,改善身体机能,抑制中重度活动性RA患者结构损伤的进展。TNF-α在RA的病理机制中起着非常重要的作用。TNF-α诱导受体激活剂核因子κB(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)的表达,并与RANKL配体协同直接促进破骨细胞分化。TNF-α还通过动员骨髓CD11b~+,促进破骨细胞前体,并通过抑制成骨细胞分化和功能来减少骨形成,从而促进骨丢失。此外,TNF-α还可诱导炎性趋化因子的产生,导致促炎细胞(包括中性粒细胞、单核细胞和活化的T细胞)的积累。首先,TNF-α刺激内皮细胞在其表面表达整合素和粘附分子,从而使白细胞积累。其次,TNF-α诱导趋化因子CXCL8、CCL2和CCL5的产生和释放,这对白细胞的生成和血管生成也有重要作用。TNF-α的第三种功能是诱导其他促炎细胞因子的释放,如IL-1、IL-6和IL-18。此外,TNF-α还刺激内皮细胞产生破骨细胞因子,如巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)。TNF-α还通过促进树突状细胞分化,使得RA患者滑膜内自身抗原呈递到T细胞,从而刺激RA的发病。依那西普是由人TNF-α受体p75的细胞外部分二聚体与人IgG1的Fc段构成的融合蛋白,结合可溶性和细胞表面跨膜形式的TNF-α,作用机制涉及竞争性抑制TNF-α和TNF-β与细胞表面肿瘤坏死因子受体的结合,调节多种免疫和炎症途径。尽管T细胞介导RA病理机制的研究有大量报道,但RA患者的血清和滑液中存在与疾病相关的自身抗体如类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrulline peptide,CCP)等,提示B细胞在RA病理机制中发挥重要作用。大约30%的病人滑膜中存在着淋巴外生发中心B细胞和浆细胞滑膜浸润。已经证明这些生发中心是B细胞依赖性的。严重联合免疫缺陷小鼠的细胞转移实验表明,利妥昔单抗耗竭B细胞后生发中心发育失败,提示B细胞在生发中心激活中的关键作用。在70-80%的RA患者中发现B细胞分化为产生RF和抗CCP抗体的浆细胞。除产生自身抗体外,B细胞是有效的抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC),导致T细胞活化。抗原特异性B细胞具有特异性抗原膜结合免疫球蛋白,B细胞可以处理和呈递抗原,效率比其他APC高1000倍。除此之外,活化的B细胞表达的共刺激分子CD80/86和CD40是T细胞活化所必需的。B细胞还产生细胞因子,如淋巴毒素,对于三级淋巴结构的发展以及IL-10、IL-4和IL-6至关重要。由此可见,B细胞在RA的发病机制中起着重要作用。但是很少关注依那西普对RA中B细胞亚群的调节作用,关于依那西普对外周血B细胞的影响的文献中也没有一致意见。课题组前期研究表明RA病人的外周血B细胞亚群存在着异常活化。综上所述,RA患者外周血B细胞亚群与实验室指标及临床指标之间是否存在相关性,以及依那西普对外周血B细胞亚群的影响,对B细胞分化的影响以及通过哪条信号通路影响分化,这都是本课题需要解决的问题。目的1.探究RA患者外周血B细胞亚群与实验室指标之间的相关性。2.研究依那西普对RA病人外周血B细胞亚群(CD19~+总B细胞、CD19~+CD27~+记忆B细胞、CD19-CD27~+CD138~+浆细胞)的影响。3.探究依那西普对B细胞分化的影响。方法1.收集临床依那西普治疗的RA病人外周血及血清,进行为期六个月随访。2.收集RA病人临床指标:肿胀关节计数(swollen joint counts,SJC)、触痛关节计数(tender joint counts,TJC)、健康评估问卷评分(health assessment questionnaire score,HAQ)、28关节疾病活动评分(disease activity score in 28 joints,DAS28)及实验室指标:红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、c-反应蛋白(c-reactive protein,CRP),并进行B细胞亚群(CD19~+总B细胞、CD19~+CD27~+记忆B细胞、CD19-CD27~+CD138~+浆细胞)和临床及实验室指标的相关性分析。3.流式细胞术检测依那西普治疗前后RA病人外周血B细胞亚群的百分比:治疗CD19~+总B细胞、CD19~+CD27~+记忆B细胞、CD19-CD27~+CD138~+浆细胞。4.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测RA病人外周血血清中炎症因子TNF-α和BAFF的水平变化情况。5.体外实验:用CCK-8法检测TNF-α对小鼠脾脏B细胞增殖的最佳浓度以及依那西普对小鼠脾脏B细胞增殖的影响。6.流式细胞术检测I型和II型过渡期B细胞上TNFRI、TNFRII及TRAF2的表达。7.流式细胞术检测TNF-α~+BAFF刺激的小鼠脾脏B细胞中成熟B细胞的百分比。结果1.RA患者外周血浆细胞(CD19-CD27~+CD138~+)与实验室参数(ESR,RF)具有相关性。总B细胞(CD19~+)、记忆B细胞(CD19~+CD27~+)与实验室参数无相关性。流式细胞术检测RA病人外周血中CD19-CD27~+CD138~+浆细胞百分比检测实验室指标。CD19-CD27~+CD138~+浆细胞百分比与ESR(p=0.034)及RF(p=0.028)之间存在显著相关性。而总B细胞(CD19~+)、记忆B细胞(CD19~+CD27~+)与实验室指标之间无相关性。2.依那西普下调RA患者外周血总B细胞(CD19~+)、记忆B细胞(CD19~+CD27~+)、浆细胞百分比(CD19-CD27~+CD138~+)。流式细胞术检测RA病人外周血中B细胞亚群水平的变化。与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月CD19~+总B细胞的百分含量是下降的;与依那西普治疗前相比,用药后三个月、六个月CD19~+CD27~+记忆B细胞的百分含量是下降的;与依那西普治疗前相比,用药后三个月、六个月CD19-CD27~+CD138~+浆细胞的百分含量是下降的。3.依那西普下调RA患者血清中高水平的TNF-α和BAFF。ELISA试剂盒检测RA病人外周血血清中炎症因子TNF-α和BAFF的水平变化情况。结果显示:相比健康对照组,RA病人外周血血清中TNF-α和BAFF的水平明显升高;相比于依那西普治疗前,用药三个月和六个月后TNF-α和BAFF的水平明显降低。4.依那西普改善RA患者临床指标(HAQ,SJC,TJC,DAS28)。与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月HAQ是显著下降的;与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月SJC是显著下降的;与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月TJC是显著下降的;与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月DAS28是显著下降的。5.依那西普降低实验室指标(ESR,CRP,RF)。与使用依那西普前相比,药后三个月、六个月ESR是显著下降的;与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月CRP是显著下降的;与依那西普治疗前相比,药后三个月、六个月RF是显著下降的。6.依那西普治疗后,患者病情改善达到ACR20/50标准。三个月后有60%患者病情改善达到ACR20标准,20%患者病情改善达到ACR50标准;六个月后有75%患者病情改善达到ACR20标准,50%患者病情改善达到ACR50标准。7.依那西普能抑制TNF-α刺激小鼠脾脏B细胞增殖反应。CCK-8法检测B细胞增殖,与空白对照组相比,经TNF-α(40ng/ml)刺激后小鼠的B淋巴细胞增殖能力明显增加;与TNF-α组相比,依那西普(40μg/ml)明显抑制TNF-α诱导的小鼠脾脏B细胞增殖反应。8.I型和II型过渡期小鼠脾脏B细胞上表达TNFRI、TNFRII及TRAF2。从正常小鼠脾脏中分离出B淋巴细胞,标记CD19-FITC,Ig D-BV421,Ig M-PE,TNFRI-APC、TNFRII-APC、TRAF2-AF64。孵育后,使用流式细胞术检测。I型和II型过渡期B细胞上表达TNFRI、TNFRII及TRAF2。9.依那西普对过渡期B细胞向成熟B细胞的分化有抑制作用。流式细胞术检测BAFF+TNF-α刺激的脾脏细胞中成熟B细胞(CD19~+Ig D~+Ig M-)的百分含量。结果提示:与空白对照组相比,BAFF+TNF-α组成熟B细胞的百分比含量显著升高;依那西普作用后,成熟B细胞(CD19~+Ig D~+Ig M-)的百分含量显著下降。结论1.浆细胞与实验室指标具有相关性,提示B细胞在RA病程中发挥重要作用。2.依那西普下调异常活化的B细胞亚群可能是其改善RA患者临床症状和恢复异常实验室指标的重要机制之一。3.依那西普可能通过调控TNFRII/TRAF2/NF-κB信号通路抑制B细胞分化。