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兔出血症病毒(RHDV,Rabbit Hemorrhagic Disease Virus)属于杯状病毒科,能够引起兔病毒性出血症(RHD,Rabbit Hemorrhagic Disease)。RHDV及其病毒样颗粒(VLPs,virus-like particles)能够吸附于成年兔呼吸道、消化道的上皮细胞上,能与A、H2型HBGAs发生结合,以上特性都依赖于ABH组织血型抗原(HAGAs,Histo-blood group antigens)的存在。目前研究发现,RHDV与诺如病毒感染宿主的机制相似,首先是与呼吸道和消化道上皮细胞上的HBGAs受体结合,从而启动病毒复制周期中的入胞环节。本研究利用H2型多糖阻断试验探索免疫血清对VP60VLPs与受体HBGAs结合的阻断效应,构建RHDV VP60蛋白特异性噬菌体肽库,筛选RHDV VP60与受体HBGAs的结合域,为进一步阐述RHDV与受体HBGAs结合的分子机制提供线索,对阐述RHDV的感染和致病机制具有重要意义。主要研究内容如下:1.免疫血清对VP60 VLPs与受体HBGAs结合的阻断效应研究表达兔出血症病毒VP60 VLPs,采用红细胞吸附释放试验进行纯化,并通过Western-blot对纯化后的VP60 VLPs进行鉴定,之后采用本实验室构建的H2型多糖结合试验分析VP60 VLPs与受体HBGAs的结合特性。测定RHD疫苗免疫后不同时间采集的血清对VP60 VLPs与受体HBGAs结合的阻断效果。结果显示,免疫后第7天至第240天的血清样品1:100稀释后,都能够有效阻断HBGAs与RHDV VLPs的结合,与PBS组相比差异显著(P<0.05)。免疫后第7天血清的阻断率接近60%,第14天和第30天的阻断率分别接近75%和85%。第60天至第240天的血清样品几乎能够100%阻断HBGAs与RHDV VLPs的结合,因此可用免疫血清阻断试验替代病毒中和试验。2.兔出血症病毒VP60蛋白特异性噬菌体肽库的构建与鉴定利用PCR扩增RHDV皖阜株VP60基因,通过DNase Ⅰ随机消化法获取100 bp左右的随机片段,T4DNA聚合酶补平,连接pEcoRⅠ Linker并经pEcoRⅠ酶切后,克隆到经pEcoRⅠ酶切并去磷酸化的pC89pⅧ型噬菌粒载体上,将重组噬菌粒转化感受态细胞XL1-Blue,并用辅助噬菌体VCSM13超感染,构建VP60蛋白特异性噬菌体随机肽库,同时对肽库的随机性和滴度进行鉴定,最后采用生物淘选和噬菌体原位杂交技术,利用该肽库对1B8、1D4、5H3和A3C4株纯化的单克隆抗体进行抗原表位的鉴定,进一步验证肽库的特异性和丰富性。结果显示,所构建多肽库的滴度约为4.3×1012PFU/mL,且插入片段大小和位置都具有良好的随机性和多样性。本研究成功构建了特异性和丰富性良好的兔出血症病毒VP60蛋白特异性随机肽库,并利用该肽库筛选到了 VP60的四个抗原表位。该肽库能够进一步用于筛选和丰富VP60的抗原表位,还可用于VP60与受体结合域的鉴定,对阐述RHDV的感染、致病和免疫保护机制具有重要意义。3.RHDV VP60与受体HBGAs结合域的筛选与鉴定利用构建的特异性和丰富性良好的兔出血症病毒VP60蛋白特异性噬菌体展示肽库,采用生物淘选和噬菌体原位杂交技术,筛选RHDV VP60与受体HBGAs的结合域,同时将结合域对应的碱基序列克隆至原核表达载体中,进行抗原表达,并利用H2型多糖阻断试验进一步验证VP60与HBGAs受体的结合域。结果显示,鉴定到2个 RHDV VP60 与受体 HBGAs 的结合域,分别为 RFADIDHR(291-298aa)、VLQFWY(312-317aa)。为进一步揭示病毒与受体HBGAs结合的分子机制奠定基础,对阐述RHDV的感染和致病机制具有重要的意义。