论文部分内容阅读
小麦叶锈菌是一种活体寄生真菌，具有明显的专化性。在不亲和组合中，当寄主细胞受到叶锈菌侵染时，与吸器母细胞接触的细胞快速死亡，即发生过敏性反应(hypersensitive reaction，HR)，使得叶锈菌无法继续从侵染细胞中吸取养分，从而限制了叶锈菌的生长和繁殖。实验室前期工作表明活性氧(reactiveoxygen species，ROS)爆发和水杨酸(salicylic acid，SA)积累与HR紧密相关;通过构建叶锈菌侵染早期的小麦SSH文库及ESTs序列分析，筛选到EDS1(enhanceddisease susceptibility1)在不亲合组合中表现上调表达。EDS1是植物免疫系统中的一个防卫信号蛋白，在基础免疫及以TIR-NB-LRR类为主的R蛋白介导的效应子触发的免疫(effectors-triggered immunity，ETI)中均发挥重要作用。本试验以小麦品种“洛夫林10”（简称L10）与叶锈菌小种260组成不亲和组合，通过施加外源SA、注射咪唑或利用病毒诱导的基因沉默技术(virus induced genesilencing，VIGS)沉默TaEDS1基因，将TaEDS1和ROS以及SA联系起来，初步探讨TaEDS1在小麦抵抗叶锈菌侵染中的作用，获得的主要结果如下: 1.在实验室前期工作的基础上优化了VIGS插入片段，构建了高效的VIGS载体，提高了对TaEDS1基因的沉默效率。 2.通过Rohringer荧光染色观察发现，TaEDS1基因沉默后，单侵染点HR面积减小，叶锈菌的吸器母细胞数量有所增加。表明TaEDS1基因在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR中具有重要作用，TaEDS1可能通过促进HR来限制叶锈菌的生长发育。 3.利用VIGS技术沉默小麦品种L10的TaEDSI基因后接种叶锈菌小种260，DAB染色结果显示，接菌后24h单侵染点H2O2的含量没有变化，48h和96h则降低;RT-qPCR技术检测小麦与叶锈菌互作过程中H2O2相关基因NAPDHoxidase，SOD，CAT和ADOR的表达趋势，发现沉默TaEDS1后，SOD表达量低于对照，ADOR表达量高于对照，而NAPDH oxidase和CAT表达量与对照无显著差异。表明在小麦和叶锈菌的不亲和组合中TaEDS1对H2O2的积累有正调控作用。对小麦L10预注射NADPH氧化酶抑制剂咪唑后接种叶锈菌小种260，通过RT-qPCR技术检测发现TaEDS1的表达量降低，说明在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中TaEDS1的表达可能依赖H2O2。 4.TaEDS1基因沉默后，利用高效液相色谱法（High Performance LiquidChromatography, HPLC）检测游离SA含量，发现基因沉默后叶片中SA含量较对照组有所降低。RT-qPCR检测发现，与SA合成密切相关的两个基因ICS和PAL的表达量在TaEDS1沉默后较对照降低，表明在叶锈菌侵染小麦诱发的HR过程中TaEDS1对SA的合成有正调控作用。对小麦品种L10施加外源SA，通过RT-qPCR技术检测了TaEDS1在喷施SA后不同时间点的表达趋势，结果显示TaEDS1的表达受到外源SA强烈诱导。 综上所述，通过研究小麦与叶锈菌不亲和互作过程中H2O2、SA和TaEDS1的关系，促进了人们对单子叶植物中TaEDS1参与诱导HR发生机制的认识，对阐明小麦抵抗叶锈菌侵染的机理意义重大。