血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment,VCI)是由各种脑血管疾病引起的以学习、记忆功能障碍为主要症状的获得性智能损害综合征,其病程发展的晚期阶段被称作血管性痴呆(vascular dementia,VD)。目前,VD已经成为世界范围内继阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)之后的第二大痴呆类型。但是,迄今为止,VD的发病机制尚不完全明确,因而缺乏有效的治疗药物。研究表明,慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)损伤在VD的发病过程中发挥着重要作用,因此探讨慢性脑低灌注损伤导致VD的发病机制,并寻求有效的痴呆防治药物成为现代医学的研究热点之一。已有的研究表明,神经元的自噬与凋亡在慢性脑低灌注损伤导致VD的发病机制中占有重要地位,因此调控神经元的自噬与凋亡对于减缓神经元损伤至关重要。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路是一条经典的抗凋亡、促存活通路,该通路的激活在缺血缺氧性神经元损伤中起着重要作用。近年来的研究表明,PI3K/Akt通路及其相关下游信号因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)的激活对于神经元自噬具有调节作用。奥拉西坦(oxiracetam,ORC)是一种新型的吡咯烷酮类促智药(nootropic drugs),化学名为4-羟基-2-酮-1-吡咯烷乙酰胺(4-hydroxy-2-oxo-1-pyrrolidineacetamide)。动物实验表明,ORC可以透过血脑屏障,能选择性地作用于海马、皮层和纹状体,提高大脑对血氧及葡萄糖的利用能力,激活、保护或促进神经细胞的功能恢复。ORC药物本身无直接的血管活性,也没有中枢兴奋作用,但可以通过增强蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)的活性、促进突触可塑性、促进大脑长时程增强(long term potentiation,LTP)的产生等多种途径,对学习、记忆功能的改善发挥持久的促进作用。但是,ORC对慢性脑缺血致痴呆大鼠的神经保护作用尚不十分清楚。基于上述研究背景,本研究通过双侧颈动脉永久结扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)建立大鼠慢性脑低灌注致VD模型,观察并探讨(1)BCCAO术后大鼠认知功能及海马组织形态变化,(2)进一步观察不同给药时间及给药剂量下ORC的神经保护作用,该神经保护作用是否与激活PI3K/Akt信号转导通路有关?(3)观察ORC对海马神经元自噬及凋亡相关蛋白表达的影响,为探讨ORC改善认知功能障碍的作用机制提供更多的理论依据。第一部分血管性痴呆大鼠模型的建立及奥拉西坦对血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:通过BCCAO方法建立大鼠慢性脑低灌注致VD模型,并观察ORC对术后4周及8周大鼠空间学习、记忆功能的影响。方法:3月龄清洁级健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,体重250-300g,随机分为4组:假手术组(sham组),模型组(vehicle组),ORC低剂量组(ORC-L),ORC高剂量组(ORC-H)。每组于术后4周、8周进行观察(每亚组10只)。采用BCCAO法制备VD大鼠模型,BCCAO术后次日开始进行药物干预。低剂量及高剂量治疗组分别给予100mg/kg和200mg/kg ORC灌胃,每日一次,假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。最后一次给药的次日,应用Morris水迷宫自动记录仪对所有存活小鼠进行为期6天的行为学测试。结果:BCCAO术后4周,总的统计结果显示,训练天数(F=166.03,P<0.01)、组间比较(F=51.132,P<0.01)以及训练天数和组别的交互作用(F=3.515,P<0.01)均具有统计学差异。与模型组相比,从第2天开始,ORC低剂量治疗组大鼠的逃避潜伏期缩短,在第3天和第5天差异最为显著(P<0.05),而ORC高剂量治疗组逃避潜伏期的缩短在第3天至第5天均具有明显的统计学意义(第3天P<0.05,第4、5天P<0.01)。在训练的5天内,ORC高剂量治疗组比低剂量治疗组的逃避潜伏期均有缩短,尤其在第4天和第5天两组之间比较具有统计学差异(P<0.05)。BCCAO术后8周,总的统计结果显示,训练天数(F=119.222,P<0.01)、组间比较(F=13.376,P<0.01)以及训练天数和组别的交互作用(F=2.011,P<0.05)均具有统计学差异。与假手术组相比,在训练的5天内模型组大鼠的逃避潜伏期均明显延长,且具有统计学意义(第1天P<0.01,第2天P<0.05,第3至5天P<0.01),提示本实验造模方法持续有效。与模型组相比,从第2天开始,ORC低剂量治疗组大鼠的逃避潜伏期缩短,在第4天(P<0.05)和第5天差异最为显著(P<0.01),而ORC高剂量治疗组逃避潜伏期的缩短在第3天至第5天均具有明显的统计学意义(P<0.01)。在训练的5天内,ORC高剂量治疗组比低剂量治疗组的逃避潜伏期均有缩短,但是仅在训练第3天时两组比较具有统计学差异(P<0.01)。空间探索实验中,与假手术组相比,VD模型组大鼠在目标象限停留时间百分比显著下降(P<0.01);与模型组相比,低剂量及高剂量治疗组大鼠在目标象限停留时间百分比均有增加(P<0.01)。在术后4周和8周整个观察期间,这种趋势持续存在,但以术后8周高剂量治疗组的效果最为明显。结论:双侧颈总动脉结扎形成慢性脑低灌注制备VD大鼠模型,在一定程度上与临床VD的发病过程相似,是VD的理想动物模型。奥拉西坦可有效改善VD大鼠的认知功能。奥拉西坦连续应用8周改善认知的效果优于连续应用4周。第二部分奥拉西坦不同剂量和不同给药时间对血管性痴呆大鼠海马组织形态学的影响目的:观察BCCAO术后大鼠行为学的改变及海马组织形态学变化。方法:行为学测试结束后,HE染色观察各组大鼠海马组织形态学变化。结果:HE染色结果发现,假手术组大鼠海马锥体细胞数量较多,无明显的神经元丢失现象,细胞排列整齐、致密,细胞形态结构完整,胞浆清亮,胞核大而圆,核仁清晰。相比之下,VD模型组大鼠术后4周、8周海马锥体细胞数量减少,神经元丢失较明显,细胞排列疏松,细胞形态不规则,胞质呈嗜酸性,胞核固缩深染,核仁消失。术后4周模型组损伤最明显,部分区域仅见少量神经元存活。在ORC低剂量及高剂量治疗组中,神经元丢失减少,仍可见少量核固缩。尤其在8周高剂量治疗组中改善明显。结论:慢性脑低灌注损伤在引起大鼠学习、记忆障碍的同时,还可导致海马组织神经元出现明显的组织病理学变化,以BCCAO术后4周模型组损伤最为显著。经过奥拉西坦干预后,治疗组大鼠认知功能改善的同时,海马神经元的损伤也得到一定程度的减轻,高剂量组效果优于低剂量治疗组。第三部分奥拉西坦对血管性痴呆大鼠PI3K/Akt通路的影响目的:观察观察血管性痴呆大鼠海马组织中Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR表达水平的变化及ORC的干预作用。方法:造模4周及8周后应用Western-Blot方法测定各组大鼠海马组织中Akt、p-Akt Ser473、m TOR和p-m TOR Ser2448蛋白的动态变化。结果:BCCAO术后4周各组之间Akt总蛋白表达无明显差异(P>0.05);与假手术组相比,模型组、ORC低剂量组和高剂量组p-Akt Ser473蛋白表达明显增强(P<0.01);与模型组相比,ORC低剂量组和高剂量组p-Akt Ser473的表达明显增强。BCCAO术后4周各组之间m TOR总蛋白表达无明显差异(P>0.05)与假手术组相比,模型组、ORC低剂量组和高剂量组p-m TOR Ser2448蛋白表达明显增强(P<0.01);与模型组相比,ORC低剂量组和高剂量组p-m TOR Ser2448的表达明显增强。BCCAO术后8周各组之间Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR的蛋白表达在各组之间的变化趋势与4周组相同。结论:慢性脑低灌注损伤导致海马神经元损伤,应用ORC干预后海马神经元损伤减轻,大鼠认知功能得到改善,该作用可能是通过激活PI3K/Akt信号转导通路来实现的。第四部分奥拉西坦对血管性痴呆大鼠海马组织凋亡及自噬相关蛋白表达的影响目的:观察血管性痴呆大鼠海马组织中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值以及自噬相关蛋白LC3II/I比值、Beclin 1、p62蛋白表达水平的变化,进一步观察ORC对神经元凋亡及自噬的干预作用。方法:造模4周及8周后应用Western-Blot方法测定各组大鼠海马组织中Bcl-2、Bax、LC3、Beclin 1、p62蛋白的动态变化。结果:与假手术组相比,术后4周模型组大鼠海马组织Bcl-2/Bax比值下降,具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,奥拉西坦治疗组Bcl-2/Bax比值升高,均具有统计学意义(P<0.05)。低剂量与高剂量组之间比较,不具有统计学差异(P>0.05)。与假手术组相比,BCCAO术后4周模型组大鼠海马组织LC3-II/I比值升高,Beclin 1蛋白表达水平明显增加,p62蛋白表达显著下降,均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。与模型组相比,奥拉西坦治疗组大鼠LC3-II/I比值下降,p62蛋白表达显著增加,高剂量治疗组大鼠较低剂量治疗组大鼠变化更明显(P<0.05);Beclin 1蛋白表达有所减少,但不具有统计学意义(P>0.05)。BCCAO术后8周各组之间Bcl-2/Bax比值、LC3II/I比值、Beclin 1、p62的蛋白表达在各组之间的变化趋势与4周组基本相同。结论:慢性脑低灌注损伤可以诱导细胞凋亡及自噬过度激活,导致海马组织神经元变性及死亡。应用奥拉西坦能够发挥神经保护作用,可能是通过调节神经元的凋亡和自噬水平而实现的。