【摘 要】
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BACE1,即β-分泌酶,是Aβ前体蛋白APP代谢产生Aβ的关键酶,活性BACE1的原核表达将为BACE1结构与功能关系的研究及特异性β-分泌酶抑制剂的筛选提供大量的材料,为最终从根本上
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BACE1,即β-分泌酶,是Aβ前体蛋白APP代谢产生Aβ的关键酶,活性BACE1的原核表达将为BACE1结构与功能关系的研究及特异性β-分泌酶抑制剂的筛选提供大量的材料,为最终从根本上治疗AD带来希望.由于BACE1酶原区有协助BACE1进行正确折叠和抑制BACE1酶活性的双重作用,为了尽可能的提高所表达BACE1的活性,在原核表达BACE1过程中,我们保留了BACE1的酶原区以保证BACE1的正确折叠,收获表达蛋白后,又设法切除BACE1酶原区以去除其抑制BACE1酶活性的作用进而获得高活性的BACE1.通过对BACE1氨基酸序列的分析,发现BACE1酶原区和功能区交接处的氨基酸序列类似于凝血酶的特异识别序列.因此,该课题首先利用PCR技术从带有BACE1正确全长序列的真核表达重组质粒pcDNA3.1-BACE1中扩增获得编码BACE1酶原区及功能区的DNA序列,并通过TA克隆及亚克隆技术构建了重组质粒pGEX-5X-1-Pro-BACE1.继而改变BACE1酶原区和功能区编码序列交接处的少数核苷酸序列,引入一编码凝血酶特异识别位点的序列,构建了原核表达重组质粒pGEX-5X-1-ThPro-BACE1.在大肠杆菌中诱导表达出可溶性GST-ThPro-BACE1融和蛋白,表达量达到28%.GST-ThPro-BACE1通过亲和层析纯化后以凝血酶切割,并经HPLC纯化得到BACE1,纯度达到99%.以带有Swedish突变位点的荧光多肽为底物,通过FRET对纯化的BACE1进行酶切活性检测,并以BACE1s标准蛋白(腺病毒转染昆虫细胞表达的蛋白)为阳性参照.用此方法检测到了BACE1相对于BACE1s标准蛋白的低活性.
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