无选择标记和无载体骨架序列的转反义ACS1基因河套蜜瓜耐贮藏品系选育

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:anbao01
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甜瓜(Cucumis melo L.)属于葫芦科甜瓜属,是一年生蔓性草本植物,甜瓜果实营养丰富、甘甜可口、风味独特,深受人们喜爱,被列为世界十大水果之一。我国是甜瓜生产第一大国,约占世界总面积和总产量的一半。本研究选用内蒙古河套地区特产的地方优良甜瓜品种河套蜜瓜。河套蜜瓜是典型的呼吸跃变型果实,果实采后快速出现呼吸高峰,果实迅速软化腐烂。提高果实耐贮性是河套蜜瓜育种重要目标之一。本实验以植物双元表达载体pPZP221(GenBank中登录号:U10491)为构建的最初载体,用MssⅠ和VspⅠ双酶切pPZP221,去掉T-DNA上的庆大霉素抗性选择标记基因aacCl(gentamycin acetyltransferasegene),并在该位点重新插入CaMV 35S启动子和nos终止子序列。将甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶1(ACS1)基因cDNA编码区0.65kb核苷酸序列反向构建到上述载体的XbaⅠ和SacⅠ位点。最后用MssⅠ和VspⅠ双酶切T-DNA左右边界两侧,获得了无植物选择标记基因和无载体骨架序列的反义ACS1基因的线性表达盒。电泳回收目的片段,回溶于0.1×SSC溶液(pH7.0)中,使中浓度达到10ng/μL。应用本实验室已建立的甜瓜花粉管通道法转基因技术将目的DNA片段导入受体材料甜瓜品种河套蜜瓜,经选育获得了T1代转基因耐贮藏品系。主要实验结果及结论如下:1、导入了30朵花,收获24颗果实,从每颗果实中随机选取10粒种子播种后经PCR检测,有6颗果实的T0种子阳性率较高。2、将从上述阳性率较高的六颗果实中各随机选取30粒T0种子,播种于大田,当果实成熟时在田间筛选出5个耐贮藏植株。3、从耐贮性好的5颗T0果实中各随机筛选出30粒种子,种植在育苗盘内,经PCR检测,将阳性苗移栽到冬季日光温室,获得耐贮藏的T1株系。4、转基因T0、T1果实在常温下可贮藏40天。此时,可溶性固形物含量与未转基因对照果实常温贮藏10天时的基本相同,而未转基因对照果实采后20天时已软化腐烂,无法进行测量。5、未转基因对照果实在贮藏10天时,硬度约3.1kg/cm2,且硬度逐渐下降,而转ACC合成酶基因反义片段的T0、T1果实贮藏40天时,果实硬度基本保持4.6kg/cm2左右。6、采后贮藏40天时转基因T0、T1果实的内源乙烯浓度均明显低于未转基因对照果实,约为对照果实的3%-5%。
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