细菌性眼内炎是眼外伤及内眼手术后的严重并发症，金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌之一，常导致视功能的严重损害。虽然及时采取玻璃体切除术联合玻璃体腔注射敏感抗生素是首选的治疗方式，但是视力预后仍不理想。因此，如何消除眼内炎中眼内组织破坏、改善最终视力预后一直是治疗细菌性眼内炎面临的难题和挑战。虽然研究证明，金黄色葡萄球菌眼内炎中视网膜损害与细菌释放的外毒素有关，但是在敲除金黄色葡萄球菌外毒素编码基因后注入动物眼内仍只能部分减轻眼内结构的损害。因此推测，眼内过度的炎症反应也可能是导致视网膜损害的因素之一，但这一观点尚无研究证实。在本研究中，我们在体外模拟细菌性眼内炎的炎症反应，观察其在视网膜靶细胞损伤中的可能作用及其具体机制。 一.金黄色葡萄球菌眼内炎体外模型中性粒细胞对RPE细胞的损伤作用 目的：观察金黄色葡萄球菌外毒素及中性粒细胞对视网膜色素上皮(RPE)细胞的毒性作用。 方法：分离人外周血中性粒细胞，和人RPE细胞株D407(RPED407)共培养，并加入金黄色葡萄球菌ATCC29213外毒素建立细菌性眼内炎体外模型。通过观察RPE细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平、流式细胞仪分析RPE细胞存活状况改变、以及Hoechst33342/PropidiumIodide(PI)染色观察细胞核的荧光染色等方法，验证金黄色葡萄球菌外毒素及中性粒细胞对RPE细胞的损伤作用。 结果：当不同剂量金黄色葡萄球菌外毒素单独作用RPE细胞时，细胞外LDH水平及RPE细胞的坏死细胞比率随着外毒素剂量增加而升高，自12h后250μl组高于外毒素空白组具有统计学意义(ANOVA；P=0.007，P=0.033)。当加入中性粒细胞共同培养后，100μl外毒素作用下，仅6h，RPE细胞外LDH水平即高于无外毒素组，差异具有统计学意义(t=1.829，P<0.05)；在6h时，流式细胞仪分析显示，RPE细胞发生了明显的细胞凋亡，并且随着中性粒细胞数量增多而加剧，差异具有统计学意义(ANOVA，P=0.0001)。Hoechst33342/PI染色显示，随着外毒素剂量增加，RPE细胞中PI染色阳性细胞明显增多。 结论：金黄色葡萄球菌外毒素对RPE细胞具有毒性作用，其机制主要以细胞坏死的方式进行。中性粒细胞超过一定数量后对RPE细胞亦具有损伤作用。外毒素和中性粒细胞共同参与时，对RPE细胞的毒性作用大于两者单独对RPE细胞的损害。 二.金黄色葡萄球菌眼内炎体外模型中细胞因子的表达情况 目的：观察金黄色葡萄球菌眼内炎体外模型下细胞因子IL-1β、TNF—α、IL—6表达水平的变化。 方法：分离人外周血中性粒细胞，和人RPE细胞株D407(RPED407)共培养，并加入金黄色葡萄球菌ATCC29213外毒素建立细菌性眼内炎体外模型。在6h、12h、24h、48h、72h等时间点搜集培养液上清，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液中IL-1β、TNF—α、IL—6表达水平的变化。 结果：当不同剂量金黄色葡萄球菌外毒素单独作用RPE细胞时，培养液中IL-1B水平随着外毒素剂量增加而上升、亦随着作用时间的延长而增加；但IL—6水平仅在24h及48h时500μl组高于对照组具有统计学意义(ANOVA，P<0.05)。RPE细胞在100μl外毒素作用下，加入不同数量中性粒细胞共培养6h、12h后，5×105组培养液中IL-1β水平高于其余各组，且12h的IL-1β水平高于6h，差异具有统计学意义(ANOVA，P<0.05)；培养液中IL—6的水平在12h时5×105组亦高于其余各组，具有统计学意义(ANOVA，P<0.05)，但在6h时5×105组与5×104组并无统计学差异(ANOVA，P>0.05)。在各时间点培养液中均检测不到明显的TNF—α表达。 结论：金黄色葡萄球菌眼内炎体外模型培养液中IL-1β和IL—6均有明显表达，其中IL—6的峰值出现晚于IL-1β，且维持短暂。细菌性眼内炎中外毒素剂量及中性粒细胞数量对引发IL-1β和IL—6的高水平有重要作用。