肢体缺血再灌注(LIR)在临床外科中较常见,如动脉损伤或栓塞后再通、断肢再植、肢体创伤及止血带的长时间应用等；特别是在地震灾难中,肢体缺血损伤的致残率与致死率非常高,值得关注。挽救缺血肢体的关键是尽快恢复血液循环,大量研究证明,LIR不仅影响局部缺血组织的存活和功能,还可造成全身炎症反应综合征(SIRS),并可能导致远隔多脏器功能衰竭(MODS)。其中,肺脏是回流静脉血进入的第一个脏器,静脉血中的有害物质最先作用于肺脏,肺脏是最易受损的器官之一,易造成急性肺损伤(ALI)。对于LIR继发性远隔器官损伤的机制目前尚不完全清楚；近年来人们对LIR致ALI的机制研究多集中在损伤与氧化应激方面,认为造成此种损伤的中心环节是大量活性氧(ROS)的产生及其引发一系列的中性粒细胞激活、炎症介质生成及蛋白酶类增多等连锁反应。远隔器官的损伤类似LIR损伤,即再灌注期重于缺血期,且损伤程度与缺血时间相关。研究结果认为,在正常温度下,骨骼肌是肢体最易缺血的组织,仅可耐受缺血4h。凋亡、坏死被认为是缺血再灌注(I/R)组织细胞的病理结局。随着研究的深入,认为自噬能够被各种损伤及氧化应激等诱发。1977年,Hourdry等首次在即将死亡的细胞中发现了自噬现象,并提出自噬可能促进细胞存活的假说。自噬与凋亡的关系是生命科学研究的一个热点,但有关ALI与自噬方面的相关研究甚少。近年来,大部分研究证实了自噬不但对缺乏营养状态下的细胞起保护性作用,而且可以促进细胞存活。另外还发现,在一定条件下,抑制自噬可以诱发细胞凋亡,而上调自噬则可以阻止细胞凋亡的起始。自噬作为新的程序性细胞死亡的方式,在I/R中的作用越来越得到重视,自噬体的形成是自噬发生的中心环节。自噬体形成与自噬相关基因有关(autophagy associated gene, ATG),现在有很多方法可以检测自噬的活性,其中免疫印迹(western blot)法检测微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain3, LC3)的表达情况最为常用。LC3蛋白I/II和Beclin-1是两个重要的自噬相关分子,被广泛地用来研究自噬的发生和发展。LC3-II被认为是自噬性细胞死亡的特异性分子标志物,含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。在肺血管细胞中,炎性标志物高表达引发自噬,LC3-II转化增加并聚集,自噬量进一步增加,从而引起肺支气管上皮细胞死亡及组织损伤。乌司他丁(ulinastatin, UTI)是从人尿中提取精制成的糖蛋白,是一种广谱的酶抑制剂,UTI降解形成的低分子产物仍对酶有高效抑制作用。UTI可抑制多种水解酶活性,稳定细胞膜和溶酶体膜的生理功能；UTI可抑制过度的炎症反应,改善循环器官灌注、保护组织器官功能。临床上,UTI最早被用于重症急性胰腺炎的治疗,现在还广泛应用于治疗SIR、MODS及ALI/ARDS,其具有改善肺气体交换,防止肺功能恶化功能。各种损伤及氧化应激等可诱发细胞自噬,而上调自噬可阻止细胞凋亡的起始。自噬溶酶体多为酸性水解酶,推测UTI可抑制自噬溶酶体,达到干预过度自噬,从而对LIR所导致的ALI具有保护效应。本研究旨在建立大鼠LIR致ALI模型,观察LIR不同再灌注时间对自噬活性的影响,研究自噬在LIR致ALI中的作用,观察UTI有效干预LIR细胞过度自噬提供依据,为减少LIR所致远隔组织器官损伤提供有效的治疗靶点。第一部分大鼠肢体缺血再灌注急性肺损伤细胞自噬及其相关蛋白的表达目的：研究大鼠双下肢缺血再灌注所致急性肺损伤(LIR-ALI)肺组织细胞早期自噬及其相关蛋白的表达。方法：1.采用大鼠双下肢缺血3h再灌注4h制备LIR-ALI模型。12只雄性SD大鼠,随机数字表法分为假手术(Sham)组,肢体缺血3h再灌注4h(I/R)组,每组6只。称质量后大鼠3%戊巴比妥钠(首剂40mg/kg,维持剂量20mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于动物手术台上。Sham组仅双侧股三角处切开皮肤,分离出股动脉,丝线标记不结扎,缝合创口。I/R组分离出股动脉后,于近腹股沟韧带处用无创微动脉夹夹闭股动脉使双下肢缺血,缝合创口再以适度松紧的橡皮带环绕结扎双下肢根部以防侧枝循环,以扪不到足背动脉搏动、双足变暗变凉为缺血成功的标志；3h后打开原切口,去除动脉夹恢复双下肢血流再灌注4h,动脉搏动恢复及双足逐渐变红变暖为建立LIR模型成功。2.再灌注4h末即刻剖开胸腔,直视下经心尖部穿刺抽取3～4ml全血,采用ELISA检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH),并放血处死大鼠。3.取双肺组织,4℃的冰0.9%NaCl溶液浸泡,肺变白后取下左肺放置于4%的多聚甲醛固定24 h以上,石蜡包埋后切片行免疫荧光染色测量,在倒置荧光显微镜下由专科医师阅片,观察肺组织免疫荧光特异性标记抗体的表达,并利用Image J2x软件进行免疫荧光强度分析。4.利用RT-PCR法检测各组肺组织Beclinl和Atg5 mRNA表达：取右侧肺组织100 mg,采用Trizol试剂盒抽提总RNA,逆转录反应合成cDNA,然后采用PCR仪进行扩增。5. Western blot法检测LC3蛋白表达：取下剩余右侧肺组织100 mg,-80℃保存,蛋白免疫印记(Western blot)测量肺组织LC3蛋白含量,将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析条带净光密度值,并计算LC3-II/GAPDH的蛋白含量比值。结果：1.大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)测：Sham组(2.35±0.03)×103U/L, I/R组(6.66+0.08)×103U/L,两组比较差异有统计学意义(t=119.242,P=0.000；P<0.01);I/R组血清LDH的活性显著升高,提示大鼠LIR模型制备成功。间接表明本方法建立的LIR模型,能够有效造成ALI。2.免疫荧光染色镜下Sham组可见正常肺组织且结构清晰,而I/R组中肺组织结构紊乱且肺泡壁增厚；免疫荧光强度值Sham组(5.54±0.23),I/R组(9.58+0.50),两组比较差异有统计学意义(t=17.979,P=0.000；P<0.01)；I/R组的肺组织免疫荧光特异性标记抗体高表达。3.肺组织Beclin 1和Atg5 mRNA相对定量表达：I/R组与Sham组Beclin1和Atg5 mRNA2-△△CT比值分别为12.79、18.36,差异有统计学意义(P均<0.01)。4. Western blot法检测LC3-I蛋白含量净光密度值Sham组1699.65±50.85,I/R组6707.37±104.45,两组比较差异有统计学意义(t=105.590,P=0.000；P<0.01)；LC3-II蛋白含量净光密度值Sham组5783.73±130.55,I/R组12961.46±500.96,两组比较差异有统计学意义(t=-33.962,P=0.000：P<0.01)；GAPDH蛋白含量净光密度值Sham组7631.27±111.61,I/R组7531.82±21.19,两组比较差异无统计学意义(t=2.144, P=0.081; P<0.01); LC3-II/GAPDH比值,Sham组0.76±0.02,I/R组1.72±0.07,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论：1.建立的LIR模型,能够有效造成ALI,LIR-ALI建模成功。2.大鼠双下肢缺血3h再灌注4h引起了肺组织免疫荧光染色特异性标记抗体的高表达；3.半定量RT-PCR法测定Beclin1和Atg5 mRNA相对表达量亦增高,促进了自噬的激活；而LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/GAPDH均显著增高,LIR-ALI导致肺组织自噬上调。总之,大鼠LIR-ALI后激活肺组织细胞自噬及其相关蛋白高表达。第二部分乌司他丁对大鼠肢体缺血再灌注急性肺损伤细胞自噬的影响目的：探讨乌司他丁对大鼠双下肢缺血再灌注导致急性肺损伤(LIR-ALI)肺组织细胞自噬的保护效应。方法：采用前述方法制备肢体缺血3h再分别灌注0,2,4,8h的LIR-ALI模型,72只雄性SD大鼠随机分为假手术+生理盐水(SO+NS)组,肢体缺血再灌注+生理盐水(I/R+NS)组,肢体缺血再灌注+乌司他丁(I/R+UTI)组,每组再分4亚组,每亚组各6只。各时点末于大鼠左侧颈内静脉分别注射NS或UTI5×104U/kg各1ml,按前述方法步骤,15min后采用ELISA法检测血LDH和免疫荧光法检测肺组织病理变化,利用RT-PCR法检测各组肺组织Beclinl和Atg5mRNA表达及Western blot法检测LC3蛋白的表达。结果：1.免疫荧光染色镜下I/R+NS组0、2、4h时点可见肺组织结构紊乱且肺泡间隔有增厚,8h时点肺泡腔明显缩小甚至出现实变现象；SO+NS及I/R+UTI两组中上述病理现象减轻。2.采用2-△△CT法分析肺组织Beclinl和Atg5 mRNA相对表达量SO+NS组中不同时点均无明显变化(P>0.05); I/R+NS组中4,8h时点与0时点比较明显增高(P<0.01或P<0.05),4时点最高(P<0.01),与SO+NS组中各相同时点比较均有明显增高(P<0.01),亦以4h时点为甚(P<0.01)；I/R+UTI组中4h时点与0时点比较明显增高(P<0.01),与SO+NS组中各相同时点比较均有明显增高(P<0.01或P<0.05),与I/R+NS组比较4h时点降低最明显(P<0.01)。3. Western blot法检测LC3-II蛋白含量及LC3-Ⅱ/GAPDH值SO+NS组中2,4,8h时点与0时点比较均明显增高(P<0.01); I/R+NS组中4,8h时点与0时点比较明显增高(P<0.01),但LC3-Ⅱ/GAPDH值2时点有所下降(P<0.01),与SO+NS组中各相同时点比较均有明显增高(P<0.01); I/R+UTI组中4,8h时点与0时点比较均明显增高(P<0.01),且与I/R+NS组比较各相同时点均有明显降低(P<0.01)。结论：1.建立的LIR-ALI模型可重复有效复制。2.大鼠双下肢缺血3h再分别灌注0,2,4,8h引起了肺组织免疫荧光染色特异性标记抗体的高表达；半定量RT-PCR法测定Beclin 1和Atg5 mRNA相对表达量亦增高,肺组织细胞自噬上调,自噬的激活以4h时点为高峰期,8h时点稍下降；Western blot法检测LC3-II蛋白含量4,8h时点高表达,自噬泡的数量4h时点亦最多。3.UTI静脉注射使得Beclin 1和Atg5 mRNA相对表达量降低,自噬下调,并使得LC3-II蛋白含量减少,说明UTI可抑制大鼠LIR-ALI自噬的发生与发展；另外,自噬的激活与自噬泡的数量均以4h时点为甚,应早期阻断LIR并给予UTI干预性治疗,且以4h内为佳。总之,乌司他丁可下调大鼠双下肢LIR-ALI肺组织细胞自噬过表达,具有良好的保护作用。