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第一章载体的构建、细胞的分离培养及转染目的构建过氧化物酶增殖物活化受体γ(Peroxisome pmlifemtor-activated receptor γ, PPARγ)基因的发夹状干扰RNA (shRNA)并携带盐酸强力霉素(Doxycycline hyclate, Dox)正向调控"Tet-On"系统的表达载体。转染大鼠BMSC,观察并比较不同浓度四环素诱导后BMSC中PPARy基因沉默情况,成骨及成脂分化情况。方法利用RNAi技术,以小鼠PPARy基因为靶基因,构建靶向小鼠PPARy基因的"Tet-On"慢病毒载体,除了携带目的基因PPARγ-shRNA外,还将携带四环素正向调控的"Tet-On"系统和红色荧光蛋白(RFP)基因标记。通过将测序正确的慢病毒载体包装并测定滴度后,转染大鼠BMSC,观察红色荧光蛋白的表达变化情况。RT-PCR (Real-time quantitative PCR)检测PPARγ-mRNA、成脂因子ADD1-mRNA和成骨因子Collagen I-mRNA的表达水平,Western blot检测PPARy蛋白、ADD1蛋白和I型胶原蛋白(Collagen I)的表达,从而确定转染后PPARγ基因的沉默效应。分别将转染的骨髓间充质干细胞(Transfected mesenchymal stem cells, tBMSC)向成骨诱导,通过转染前后碱性磷酸酶(ALP)定性检测成骨分化能力；向成脂分化方向诱导,通过转染前后油红-O染色对比成脂能力。结果设计并筛选出shRNA序列：GTCTGCTGATCTGCGAGCC.成功构建了PPARy基因的"Tet-On"’慢病毒载体,测量滴度为3.6×10E8TU/ml,转染大鼠BMSC后,与未转染BMSC比较,PPARy-mRNA24h (hours)抑制率为36%(P<0.01); ADD13d(days)下调表达32%(p<0.05),7d表达下调75%(p<0.01)；I型胶原3d表达上调37%(p<0.05),7d表达上调66%(p<0.01);48h PPARy蛋白抑制率为53%(p<0.01)。与未转染BMSC比较,转染的tBMSC成骨诱导9d后,在2-8μg/ml时随盐酸强力霉素(Doxycycline hyclate, Dox)的浓度增大ALP活性增强,在8μg/ml成骨能力最强,在10μg/ml时呈现下降趋势；成脂诱导14d后,OD值测定tBMSC组显著降低61%(p<0.01)。结论慢病毒转染大鼠BMSC转染效率高,转染的BMSC增殖能力强,成脂分化减弱,成骨分化增强,传代后PPARy沉默效应稳定。Dox对目的基因表达调控存在浓度依赖关系,在8μg/ml时Dox调控作用最强。第二章HA/PLLA涂层BCP支架材料制备、Dox微球的制备与支架复合目的采用将Dox包裹于微球中,再沉积于生物活性双相磷酸钙(Biphasic calcium phosphate, BCP)支架上,组成组织工程"BCP/Dox"缓释系统。方法采用的是有机泡沫浸渍法制备圆盘状2mmx5mm (直径R=5mm)BCP多孔支架,用羟基磷灰石／左旋聚乳酸(HA/PLLA)涂层两遍。通过双乳液法制各聚乙丙交酯-聚乙二醇(PLGA-mPEG, LA/GA=9:1)共聚物载Dox微球,将制备出的载药微球涂层BCP多孔支架上,傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电镜(SEM)对支架材料的表面结构和形态学进行分析,并进行体外PBS溶液中的释药实验。结果制备的的载Dox微球载药量为0.5%,包封率为24.7%；电镜显示微球尺寸在15-20μm,大小分布均匀,在孔径300-600μm的多孔HA/PLLA涂层BCP支架上容易粘附。体外PBS缓冲液中释放显示,前16h内有爆释现象,其中8h释放月32.6%,7d释放65.5%,7d后进入缓慢释放阶段,可控制释放约60d。结论BCP支架孔径为300-600μm、孔隙率90.8%-92.3%、力学性能4.8-5.73MPa,可以满足松质骨压缩强度的要求。载Dox微球大小均匀,可以良好地附着BCP多孔支架上,有良好缓释作用。第三章复合tBMSC的多孔BCP/Dox支架治疗大鼠骨缺损的研究目的将‘’BCP/Dox"支架缓释系统,复合转染的大鼠tBMSC后,植入骨缺损处。通过Dox缓慢持续释放,调控tBMSC在骨缺损处向成骨方向分化,作为骨修复材料治疗大鼠骨骨缺损,探讨骨缺损的靶向基因治疗新的方法和策略。方法体外实验利用BMSC和tBMSC对BCP/Dox支架在6h和24h时的粘附,细胞计数后验证支架的粘附性；通过1、3、5d的MTT实验去验证BCP/Dox支架对细胞增殖的影响；通过诱导9d时的ALP染色和11d时茜素红染色验证BCP/Dox支架对BMSC和tBMSC的成骨分化的影响；14d后油红-O染色验证支架材料对BMSC和tBMSC成脂分化的影响。体内验证BCP/Dox支架的急性毒性实验、致敏试验、溶血实验。实施异位成骨实验,采用SD-大鼠30只,制作右大腿后内侧肌袋,植入一片BCP/Dox支架材料,分别在1d、1w、2w、3w和4w分批处死各6只取材并进行HE染色,观察免疫反应和异位成骨情况。SD-大鼠45只,制作大鼠颅骨右后囟5mm圆形骨缺损模型,随机分为A组9只、B组18和C组18只,A组为空白对照；B植入P4代BMSC+BCP/Dox; C组植入P4代tBMSC+BCP/Dox。在4、8和12w分批处死,X线和Micro-CT分析支架的成骨量。结果在BCP/Dox支架的影响下,6h和24h后tBMSC组比BMSC组粘附率低,两组比较无统计学意义(p>0.05),24h后粘附率均在70%以上。增殖率在1d和3d各组无明显区别；5d后,tBMSC+BCP/Dox组和BMSC+BCP/Dox组增殖率低于BMSC组,无统计学意义(p>0.05)。5d后电镜扫描显示BCP/Dox支架细胞周围有细胞外基质及载Dox的PLGA-mPEG微球。三组细胞的ALP定量分析,6d和9d时,BMSC+BCP/Dox组较BMSC组有明显统计学意义(p<0.01); tBMSC+BCP/Dox组较BMSC+BCP/Dox组有明显统计学意义(p<0.01)；12d时,两组与对照组比较均有明显统计学意义(p<0.01)。钙结节染色,显示三组细胞外散布钙结节,tBMSC+BCP/Dox组>BMSC+BCP/Dox组>BMSC组。油红-O染色分析,诱导14d后,tBMSC+BCP/Dox组较BMSC+BCP/Dox组和BMSC组明显减少,有明显统计学意义(p<0.01)；BMSC+BCP/Dox组<BMSC组有统计学意义(p<0.05)。X线显示4w缺损边缘与材料边缘连接紧密,8w时两支架组可见缺损边缘与材料连接、分界不清,12w时tBMSC+BCP/Dox组骨缺损处显示更高的密度影,边缘不清；灰度分析显示,12w后BMSC+BCP/Dox组较BCP/Dox支架密度增高(p<0.05),tBMSC+BCP/Dox组较BMSC+BCP/Dox组密度增高(p<0.01)。Micro-CT显示12w时,tBMSC+BCP/Dox组较BMSC+BCP/Dox组和BCP/Dox支架骨量显著增高(p<0.01),BMSC+BCP/Dox组较BCP/Dox支架骨量显著增高(p<0.01)。结论BCP/Dox支架有良好的生物相容性,tBMSC在支架上具有良好的粘附、增殖和成骨分化能力。多孔BCP/Dox支架复合tBMSC具有良好的骨缺损修复能力。