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当前,随着临床前药代动力学研究的不断发展,对分析方法的要求也越来越高,并且由于生物样本的复杂性,使得体内药物分析方法的建立困难。因此,迫切需要建立灵敏度更高、准确性更好、速度更快、效率更高的科学分析方法对生物样品中的目标化学成分进行定性定量研究。在线固相萃取这一先进的样品前处理技术的出现,很好的满足了以上分析需求。本文依据此技术建立了全自动在线SPE-HPLC-DAD系统和在线SPE-HPLC-MS/MS系统并分别应用于拉米夫定和司他夫定的药代动力学研究中,从而实现了省时、省力、高通量。
基于以上所述,本文研究内容包括以下几点:
(1)建立全自动在线SPE-HPLC-DAD方法测定小鼠血浆中拉米夫定的血药浓度,研究拉米夫定在小鼠体内的药动学特征。色谱条件:LiChrospher(R)RP-18ADS在线SPE柱(25 mm×4 mm,25μm),洗脱剂为5 mmol·L1KH2PO4缓冲液(pH6.5),Venusil MP C18分析柱(150 mm×4.6 mm,5μm),洗脱剂采用乙腈-5mmol·L-1 KH2P04缓冲液(pH6.5)(8∶92,V/V),流速1 ml/min,等度洗脱;检测波长272 nm。单个样品分析时间为10 min。拉米夫定线性范围为100-50000ng·mL-1,最低定量限为100 ng·mL-1,绝对回收率为91.91-100.78%,日内、日间精密度RSD为4.23-9.57%,短期、冻融及长期稳定性RSD均小于5.08%。
(2)建立司他夫定的全自动在线SPE-HPLC-DAD测定方法。色谱条件:LiChrospher(R)RP-18 ADS在线SPE柱(25 mm×4 mm,25μm),洗脱剂为5mmol·L-1KH2PO4缓冲液(pH6.5),VenusilMP C18分析柱(150mm×4.6mm,5μm),洗脱剂采用乙腈-5 mmol·L-1 KH2PO4缓冲液(pH6.5)(5∶95,V/V),流速1 ml/min,等度洗脱;检测波长267nm,单个样品分析时间为18 min。司他夫定线性范围为200-20000 ng·mL-1,最低定量限为200 ng·mL-1,绝对回收率为98.58-100.76%,日内、日间精密度RSD为2.06-2.70%,短期、冻融及长期稳定性RSD均小于4.08%。
(3)建立司他夫定的全自动在线SPE-HPLC-MS/MS测定方法,研究司他夫定在小鼠体内的药动学特征。并采用响应面法(RSM)进行优化,确定该方法的最优条件:分析柱洗脱剂采用乙腈-10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液(pH7)(20∶80,V/V),流速1 ml/min,等度洗脱;SPE柱洗脱剂为10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液(pH7);基质洗脱时间(t(M))1 min,反向洗脱时间(t(T))1 min。扫描目标化合物司他夫定离子对为m/z225.2→m/z127.1,扫描时间为5 min。司他夫定线性范围为20-10000 ng·mL-1,最低定量限为20.0 ng·mL-1,绝对回收率为97.98-100.12%,基质效应范围为98.54-99.07%,日内、日间精密度RSD为2.54-3.56%,短期、冻融及长期稳定性RSD均小于4.37%。
以上分析方法对当前较难分析的核苷类逆转录酶抑制剂(拉米夫定和司他夫定)在小鼠体内的药代动力学研究结果表明,与常规液相相比,其选择性、线性、精密度、准确度和绝对回收率均更好,方法的重现性好,准确可靠。