腈水合酶(NHase,EC 4.2.1.84)是一种存在于原核和真核生物中的金属酶,能够催化腈类生成相应的酰胺类产物,而酰胺类产物作为重要的化工原料和有机合成中间体,在大宗化学品生产及医药领域有着广泛的应用。相较于传统的化学催化剂,腈水合酶转化腈类体现出一定的优势,反应条件温和且反应过程中无副产物产生。尽管如此,现阶段已报导的NHase大多底物谱较窄,选择性较差,难以定向高效地合成目标产物;此外,腈水合酶所催化的腈类水合反应为放热反应,而该酶热稳定性往往较差,以上这些因素限制了腈水合酶在更广范围内的应用。本文通过半理性设计,基于生物信息学与蛋白质工程,改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物以及外消旋腈类底物的区域选择性和对映选择性,并通过基因融合技术,提高了腈水合酶的热稳定性,主要研究结果如下:(1)基于序列比对,通过定点突变改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性。以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668来源的腈水合酶(PpNHase)和睾丸酮丛毛单胞菌Comomonas testosteroni来源的腈水合酶(CtNHase)为对象,研究两者对二氰基底物的催化特点。结果发现,PpNHase主要催化α,ω-二腈中的一个氰基,生成反应中间产物ω-氰基单酰胺,而CtNHase催化己二腈主要生成反应终产物α,ω-二酰胺,即二腈类底物的两个氰基都能被催化。通过比对PpNHase和CtNHase的一级氨基酸序列,发现两者的序列相似度达到95.6%。两者共有17个不同的氨基酸位点,分布于α和β两个亚基上。以Ct NHase为模板,将PpNHase中的上述17个氨基酸突变为CtNHase对应位点上的氨基酸残基,17个突变体中βL37F突变体催化二腈类底物的区域选择性发生了改变,随后对该位点进行了饱和突变,最终得到催化二腈类底物主要生成α,ω-二酰胺的三个突变体,βL37F、βL37W和βL37Y。另外,对CtNHase上β亚基37位的苯丙氨酸残基也进行了定点饱和突变,得到了主要生成ω-氰基单酰胺的两个突变体,βF37L和βF37P。基于Caver软件对底物通道的对比发现,底物通道的瓶颈越大,曲率越小,腈水合酶趋向于催化二腈中的两个氰基,生成二酰胺;而底物通道的瓶颈越小,曲率越大,腈水合酶趋向于只催化二腈中的一个氰基,生成ω-氰基单酰胺。(2)基于分子对接,通过定点突变改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性。构建来源于玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1中低分子量腈水合酶(L-NHase)的蛋白模型,通过分子对接将己二腈,丙二腈,邻苯二腈和对苯二腈与腈水合酶活性中心进行对接,判断构成底物结合口袋的氨基酸残基。对底物结合口袋氨基酸进行饱和突变,得到了βY68T和βW72Y两株单点突变体,他们对于二腈类底物的区域选择性发生了改变,由偏好生成二酰胺变为偏好生成ω-氰基单酰胺。进一步的迭代饱和突变得到只生成氰基单酰胺的双点组合突变体Y68T/W72Y。计算机辅助手段分析显示,Y68T/W72Y组合突变对于氰基单酰胺产物的结合能力变弱,结合自由能增加,导致单酰胺不能被进一步转化成二酰胺,区域选择性发生改变。(3)基于拉伸分子动力学模拟,通过定点突变改变了腈水合酶对于外消旋腈类底物的对映选择性。以L-NHase为研究对象,借助于蛋白建模及拉伸分子动力学模拟,准确定位了影响L-NHase对外消旋扁桃腈对映选择性的四个氨基酸残基,并对这四个氨基酸残基进行饱和突变。突变株对于(S)-扁桃腈的选择性明显提高,其中突变体βF37H表现出96.8%的对映体过剩率,远高于野生型的52.6%。拉伸分子动力学模拟分析发现,突变体增大了对(R)-扁桃腈的空间位阻,从而突变体βF37H偏向于选择(S)-扁桃腈。(4)基于蛋白质融合提高了腈水合酶的稳定性。以L-NHase为研究对象,将一种高热稳定的加帽蛋白TERM融合至L-NHase的C端,得到新的融合型腈水合酶。该融合型腈水合酶在50°C处理20分钟后依然保持80%以上的残余酶活,远高于野生型的40%。透射电子显微镜观测发现融合后的腈水合酶可形成直径约为25 nm的环状纳米结构,蛋白建模结果显示该环状结构可能为L-NHase的多亚基聚集体,多聚体的形成降低了酶分子的比表面积,有利于稳定性的提高。