猪股骨降血压肽酶解条件的优化及其分离纯化的研究

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本论文以猪股骨头为原料,分别用两种酸性、中性、碱性蛋白酶通过酶解制备降血压肽,以ACE抑制率和水解度(DH)为指标,分别筛选出一种酸性、中性、碱性蛋白酶作为酶解用酶;根据每种酶的单因素和响应面试验优化酶解条件;在此基础上,对三种酶在各自最优酶解条件下进行了复合实验;利用超滤、离子交换层析和凝胶层析等分离纯化技术从酶解液中分离纯化降血压肽。筛选出的酸性、中性、碱性蛋白酶分别是木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶。木瓜蛋白酶的水解条件优化结果:温度55℃、pH6.14、时间4.38h、酶底比6000U/g、底物浓度8%,此时ACE抑制率为71.50%;风味蛋白酶的水解条件优化结果:温度53.8℃、pH7.0、时间4.85h、酶底比12000U/g、底物浓度6%,此时ACE抑制率为85.87%;碱性蛋白酶的水解条件优化结果:温度58.2℃、pH10.09、时间7h、酶底比12000U/g、底物浓度6%,此时ACE抑制率为80.09%。在各种酶的最优水解条件下,加酶顺序依次为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶,酶解液ACE抑制率和水解度最高,此时ACE抑制率为93%,水解度为23.42%。采用截留分子量为10KDa、5KDa两种规格的超滤离心管对酶解液进行超滤分离,得到了大于10kDa、5kDa-10kDa和小于5kDa的3个分子量肽段的组分,其中,分子量<5kDa的组分ACE抑制率最高,IC50值为1.4022mg/mL。针对超滤后分子量小于5KDa的组分,采用离子交换层析进一步分离纯化,通过考察洗脱流速、离子强度、洗脱液pH值对分离效果的影响,获得最适分离纯化条件。结果表明:A液为pH=4.0,0.02mol/L醋酸钠,B液为含1mol/LNaCl的pH=4.0,0.02mol/L醋酸钠,流速为1ml/min,离子交换层析分离纯化ACE抑制肽效果最佳。此条件下分离得到了4个峰,其中峰2的ACE抑制活性最高,其IC50值为0.4884mg/mL。针对峰2,采用凝胶层析进一步分离纯化,通过考察洗脱流速对分离效果的影响,获得最适分离流速为0.5ml/min。此条件下分离得到了4个峰,其中峰2的ACE抑制活性最高,其IC50值为0.1953mg/mL。
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