随着生活方式的改变,慢性前列腺炎（chronic prostatitis,CP）发病率不断增加,其中以Ⅲ型前列腺炎最为常见。Ⅲ型前列腺炎患者以盆腔区域疼痛不适、排尿异常为主要症状,甚至导致精神心理异常、性功能障碍等问题,严重影响男性的生活质量。现代医学多以α受体阻滞剂、抗生素及非甾体类抗炎药等治疗,但患者临床症状改善不理想,或虽有缓解但停药后易反复发作,导致Ⅲ型前列腺炎治疗满意度较低。中国中医科学院西苑医院男科采用归黄方治疗Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证,前期研究表明,采用归黄方治疗6周后,可显著降低患者美国国立卫生院慢性前列腺炎症状指数（National Institute of Health-chronic prostatitis symptom index,NIH-CPSI）评分,以及降低中医症状评分,治疗过程未见明显的不良反应。但前期研究样本量较小,因此临床研究部分,通过随机对照试验（randomized controlled trial,RCT）研究,进一步明确归黄方治疗Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证的有效性与安全性。前期实验结果表明,归黄方可明显减轻Ⅲ型前列腺炎大鼠前列腺组织病理炎症情况,减轻促炎细胞因子表达水平,这一作用与抑制PI3K、NF-κB等有关。而NLRP3炎症小体作为调控炎症反应的重要蛋白,已报道在CP大鼠前列腺组织中NLRP3炎症小体表达增加,下游促炎细胞因子释放增加。活化NLRP3炎症小体需要两个步骤:一是NLRP3炎症小体诱导装配过程,这一过程与NF-κB等有关;另一步是NLRP3炎症小体组装激活过程,这一过程与ROS释放、K+外流等有关。前期研究表明归黄方可抑制NF-κB表达,那么归黄方是否通过抑制NF-κB,进而调控NLRP3炎症小体的诱导装配过程?同时归黄方能否抑制NLRP3炎症小体组装激活过程?因此,本研究通过动物实验和细胞实验,验证归黄方是否通过抑制NLRP3炎症小体诱导装配和组装激活过程,发挥治疗Ⅲ型前列腺炎的作用。同时,NLRP3炎症小体活化后除引起促炎症因子释放,还可引发细胞焦亡（pyroptosis）。虽然细胞焦亡在多种慢性炎症性疾病中起着重要作用,但其在Ⅲ型前列腺炎中的作用尚未完全阐明。因此,本研究提出假说,归黄方可能通过抑制NLRP3炎症小体诱导装配和组装激活过程,进而抑制Caspase-1活化,阻止GSDMD切割裂解,减少促炎细胞因子IL-1β和IL-18释放,抑制细胞焦亡,发挥治疗Ⅲ型前列腺炎的作用。目的1.通过RCT临床研究,明确归黄方治疗Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证的有效性与安全性,为归黄方的推广应用提供循证依据;2.通过动物实验和细胞实验,阐释归黄方通过调控NLRP3炎症小体活化,抑制细胞焦亡治疗Ⅲ型前列腺炎的可能作用机制。方法1.临床研究 本研究为随机、对照试验,纳入Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证患者120例,均于2021年6月-2022男1月就诊于中国中医科学院西苑医院男科门诊,符合Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证的纳排标准,并已通过伦理审查,伦理批件号:2021XLA048-2。采用SAS产生随机数字,按1:1随机分为两组,试验组60例给予归黄方（药物组成:当归、黄柏、姜黄、白芷、乳香、没药、金银花、白花蛇舌草、车前草、陈皮）,服用方法:每日2次,一次1袋;对照组60例给予盐酸坦索罗辛缓释胶囊（国药准字H20050392）,服用方法:每日睡前服用1次,1次1粒。连续服药6周,并随访4周。主要疗效指标采用公认的NIH-CPSI评分;次要疗效指标为中医症状评分、前列腺液常规。安全性评价指标为血、尿常规、肝功（ALT、AST）、肾功（BUN、Cr）、心电图,入组前和观察完成后各检查1次。2.动物实验 将50只SD大鼠采用随机数字表法将其随机分为空白组、模型组、归黄方低、中、高剂量组,每组10只。除空白组外,其余4组制备自身免疫性Ⅲ型前列腺炎大鼠模型。造模成功后,空白组和模型组采用生理盐水灌胃,归黄方低、中、高剂量组分别予4.9g/kg·d、9.8g/kg·d、19.6g/kg·d归黄方灌胃,灌胃30d后安死术,取材检测。采用HE染色观察前列腺组织炎性细胞浸润情况,ELISA法检测大鼠血清促炎细胞因子IL-1β、IL-18水平,生化检测大鼠血清MDA、T-SOD、GSH-Px水平,荧光检测前列腺组织中ROS表达,免疫组化检测前列腺组织NLRP3表达,免疫荧光检测前列腺GSDMD表达,Western Blot检测前列腺组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白的表达。3.细胞实验 将人正常前列腺上皮细胞（RWPE-1细胞）分为空白组、模型组、归黄方组、NLRP3抑制剂组。除空白组外,其余3组采用LPS100ng/mL刺激4h后,ATP5mM刺激30min,制备细胞焦亡模型。造模成功后,空白组和模型组给予空白血清,归黄方组加入6.25ug/ml的归黄方含药血清,NLRP3抑制剂组在模型组的基础上加入MCC 950。通过UPLC-Q/TOF-MS确定归黄方含药血清成分,透射电镜观察细胞焦亡形态,流式细胞检测PI摄取,生化检测细胞上清中LDH水平,流式细胞检测Caspase-1表达,Tunel染色检测,流式细胞术检测ROS,生化检测MDA、T-SOD、GSH-Px 表达,ELISA 法检测细胞上清中 IL-1β、IL-18 水平,Western Blot检测 NLRP3、Caspase-1、GSDMD 的蛋白表达。结果1.临床研究（1）本临床研究共入组受试者120例,其中试验组60例,对照组60例。研究结束共脱落病例8例,其中试验组3例,对照组5例。剔除病例2例,试验组和对照组各1例。最终符合方案集（PPS）的病例共110例,其中试验组56例,对照组54例。（2）试验组与对照组治疗前后组内比较显示,试验组在治疗6周结束后,NIH-CPSI评分由（28.34±9.23）降低为（6.78±3.53）;对照组在治疗结束后,NIH-CPSI评分由（27.81±8.28）降低为（14.48±4.27）。试验组中医症状评分由（19.21±2.58）分降低为（5.11±1.09）分,对照组中医症状评分由（17.49±2.21）分降低为（11.28±1.94）分。组内比较显示,两组均可降低NIH-CPSI总评分、疼痛评分、排尿评分及生活质量影响评分、中医症状评分（P＜0.05）。ⅢA和ⅢB分层统计结果与整体结果一致。（3）试验组与对照组同期比较,除治疗第2周时排尿评分与对照组无明显差别以外（P＞0.05）,第4周、6周、10周时试验组在降低NIH-CPSI总评分、疼痛评分、排尿评分、生活质量影响评分及中医症状评分方面,与对照组同期比较,均优于对照组（P＜0.05）。ⅢA和ⅢB分层统计结果与整体结果一致。（4）前列腺液常规结果显示,组内比较治疗后两组WBC减少,卵磷脂小体增加（P＜0.05）。组间比较,试验组减少WBC数目、增加卵磷脂小体数量优于对照组（P＜0.05）。（5）安全性评价:血尿常规、肝肾功、心电图检查两组治疗后均无明显异常。试验组1例因空腹服药出现胃胀,改为餐后服药胃胀消失,另1例因未温服出现腹泻,改为温服后腹泻消失。对照组3例患者服药后出现一过性低血压,嘱睡前服用后不适消失。其余受试者在治疗过程未见明显的不良反应。2.动物实验（1）HE染色结果显示,与空白组比较,模型组前列腺组织炎性细胞浸润明显（P＜0.001）。与模型组比较,归黄方低、中、高组均可减轻前列腺组织炎性细胞浸润,显著改善Ⅲ型前列腺炎模型大鼠前列腺组织病理学变化（P＜0.001）。（2）ELISA结果显示,模型组大鼠血清促炎细胞因子IL-1β、IL-18水平升高,与空白组比较有显著统计学意义（P＜0.001）;归黄方干预后,显著降低IL-1β、IL-18水平,与模型组相比有显著统计学意义（P＜0.001）。（3）生化检测结果显示,模型组大鼠血清MDA水平升高,归黄方干预后,显著降低MDA水平（P＜0.001）;模型组T-SOD、GSH-Px水平降低,归黄方干预后,显著升高 T-SOD 水平（P＜0.001）、GSH-Px 水平（P＜0.05）。（4）模型组前列腺ROS荧光阳性染色,归黄方干预后,ROS阳性染色减少,且归黄方高剂量组更为明显。（5）NLRP3免疫组化结果显示,模型组大鼠前列腺组织中NLRP3表达增加,归黄方干预后,显著降低NLRP3表达。（6）GSDMD免疫荧光结果显示,模型组大鼠前列腺组织中GSDMD表达增加,归黄方干预后,GSDMD荧光强度明显降低。（7）Western Blot结果显示,大鼠前列腺组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达,模型组较空白组均明显增加（P＜0.001）;归黄方干预后,显著降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达,尤以归黄方高剂量组明显（P＜0.001）。3.细胞实验（1）UPLC-Q/TOF-MS测定归黄方含药血清成分,主要为熊果酸（Ursolic acid）、柚皮黄素（Natsudaidain）、乳香醇 Ⅰ（Olibanumols Ⅰ）、β-乳香酸（β-Boswellic acid）、紫花前胡苷（Nodakenetin）等。（2）CCK-8检测,确定归黄方含药血清作用于RWPE-1细胞的最佳浓度为6.25ug/ml。（3）光镜下观察,模型组死亡细胞较多,细胞形态不规则,胞浆杂质多,细胞核不清;归黄方组与抑制剂组与模型组比较,漂浮死亡细胞减少,细胞界限清楚,胞浆清晰,胞核清楚。（4）透射电镜显示,模型组细胞变大变圆,细胞膜破裂,气泡状凸起物、伴膜孔,呈典型的细胞焦亡形态。（5）流式细胞检测PI摄取,模型组RWPE-1细胞PI摄取率增加,与空白组比较PI摄取率明显提高（P＜0.001）。归黄方组和抑制剂组PI摄取率降低,与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。（6）模型组LDH释放增多,说明细胞破裂内容物释放增多（P＜0.001）。归黄方含药血清及MCC950干预后,LDH的释放受到了抑制,与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。（7）流式细胞检测Caspase-1表达,模型组Caspase-1表达显著高于空白组（P＜0.001）,归黄方组和抑制剂组Caspase-1降低,与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。（8）TUNNEL染色,模型组TUNNEL染色阳性细胞较空白组增加;归黄方组和抑制剂组,TUNNEL染色阳性染色细胞明显减少。（9）流式细胞检测ROS,模型组细胞中ROS水平明显升高,与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.001）;归黄方和抑制剂组ROS水平明显降低,与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。（10）生化检测过氧化指标MDA,模型组与空白组相比MDA水平显著升高,有显著统计学意义（P＜0.001）;归黄方组和抑制剂组,MDA水平显著低于模型组,差异有显著统计学意义（P＜0.001）。T-SOD和GSH-Px检测,与空白组相比,模型组T-SOD水平降低,差异有显著统计学意义（P＜0.001）,模型组GSH-Px水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;归黄方和抑制剂组T-SOD明显高于模型组,有显著统计学意义（P＜0.001）;归黄方和抑制剂组GSH-Px高于模型组,有统计学意义（P＜0.01）。（11）ELISA检测结果,模型组细胞上清液中IL-1β和IL-18水平均显著高于空白组,有显著统计学意义（P＜0.001）;归黄方组和抑制剂组IL-1β和IL-18水平明显降低,与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。（12）Western Blot检测,与空白组比较,模型组NLRP3炎症小体各组分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平升高（P＜0.05）;归黄方组和抑制剂组NLRP3、Caspase-1、GSDMD的蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论1.临床研究表明,归黄方可显著降低Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证患者NIH-CPSI总评分、疼痛评分、排尿评分、生活质量影响评分及中医症状评分,降低WBC数量、增加卵磷脂小体数量。疗效均优于盐酸坦索罗辛缓释胶囊,且治疗前后未见严重不良反应,安全性高,值得在临床推广应用。2.动物实验表明,归黄方可明显减轻Ⅲ型前列腺炎大鼠前列腺组织病理炎症,减轻氧化应激损伤。同时,归黄方可通过抑制NLRP3炎症小体诱导装配和组装激活过程,进而抑制Caspase-1活化,阻止GSDMD切割裂解,抑制细胞焦亡的发生,减少促炎细胞因子IL-1β和IL-18释放引起的炎症级联反应,发挥治疗Ⅲ型前列腺炎的作用。3.细胞实验表明,LPS和ATP联合刺激可制备RWPE-1焦亡细胞模型;归黄方含药血清可通过抑制NLRP3炎症小体活化,发挥抑制RWPE-1细胞焦亡的作用。总之,本研究明确了归黄方治疗Ⅲ型前列腺炎湿热瘀滞证的有效性与安全性,证实了归黄方通过调控NLRP3炎症小体活化,抑制细胞焦亡治疗Ⅲ型前列腺炎的作用机制。