宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，研究证实95％以上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）感染。HPV是无包膜的双链闭合环状 DNA病毒，能特异性感染人的皮肤和黏膜。目前已发现的 HPV约有200个亚型，与宫颈癌直接相关的13个高危型中，HPV16、18亚型约占75%，而HPV16是与宫颈癌联系最紧密的基因型。降低高危型HPV感染对预防宫颈癌具有重要意义，而HPV疫苗接种成为预防宫颈癌的重要手段。目前，已通过FDA批准的二价、四价和九价 HPV VLPs疫苗为昆虫细胞或酵母细胞表达的基因工程亚单位疫苗，这些疫苗的保护效果已被临床证实，但由于生产工艺复杂、成本高，新的更为廉价的疫苗研发策略仍是目前宫颈癌防控研究的热点。国内HPV疫苗研究相对落后，在包括HPV结构蛋白高效表达、纯化及其快速检测、病毒粒子组装、广谱疫苗的研制等方面存在较多问题。　　为了研究一种高效、低成本的制备HPV VLPs疫苗的方法，本研究利用生物信息学方法分析HPV16不同变异株 L1基因的差异，结合现有研究对不同变异株L1蛋白的重组表达效率进行分析，从中筛选出适于HPV VLPs疫苗开发的基因序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性和mRNA结构等优化并合成HPV16 L1基因，并将其克隆至不同的原核表达载体，构建pET28a-16 L1、pET32a-16 L1、pGEX-4T-16 L1、pHSIE-16 L1、pHSE-16 L1及pESUMO-16 L1六种重组原核表达载体。经分析融合蛋白TRX-16 L1、GST-16 L1、SUMO1-16 L1及SUMO2-16 L1均能得到高效表达；但TRX-16 L1以无活性包涵体形式表达，GST-16 L1、SUMO1-16 L1及SUMO2-16 L1有部分以可溶形式表达，其中SUMO1-16 L1及SUMO2-16 L1可溶性蛋白表达量相对较高。综合考量两种融合蛋白标签的切割形式、切割效率、成本等因素，本研究选择pESUMO-16 L1用于HPV16 L1蛋白的重组表达与制备。经诱导表达工艺优化，SUMO1-16 L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量能达到260mg/L。经纯化可获得纯度为95%的SUMO1-16 L1蛋白。随后本研究将Ulp1蛋白（SUMO蛋白酶）第403~621 aa活性片段C端引入6×His标签后克隆至pGEX6P-1载体并进行融合表达，经纯化及活性分析结果显示融合蛋白GST-Ulp1P-His可用于特异性切割SUMO1-tag。经DLS检测和TEM观察，去除SUMO1标签后，HPV16 L1蛋白在合适的条件下可装配成VLPs。经血凝实验证实，该VLPs具有类似HPV病毒的凝集小鼠红细胞的血凝活性。初步的动物实验结果显示本研究获得的HPV16 VLPs疫苗能有效刺激小鼠产生针对HPV16的特异性抗体及中和抗体。　　包括VLPs疫苗在内的多种基因工程亚单位疫苗在刺激B细胞免疫反应方面具有良好的表现，但在激活T细胞免疫反应方面却不如全病毒疫苗或者DNA疫苗。为了研究一种能够同时刺激T细胞免疫反应和B细胞免疫反应的新型HPV疫苗，本研究采用HPV16 VLPs包裹含有HPV16 L1蛋白编码基因的重组表达质粒pcDNA3.1-HPV16 L1，进行VLPs-DNA疫苗的探索性研究。利用HPV16 VLPs在不同的离子环境下可以去装配和再装配的特点，本研究制备HPV16 VLPs包裹pcDNA3.1-HPV16 L1基因的VLPs-DNA嵌合疫苗。动物免疫结果显示：单独的VLPs疫苗及分别与弗氏佐剂或铝佐剂配比的VLPs疫苗均能有效刺激机体产生针对HPV16亚型的特异性抗体和中和抗体；同时也能刺激机体产生一定的T细胞免疫应答；单独靠皮下注射pcDNA3.1-HPV16 L1的裸DNA疫苗仅能刺激机体产生T细胞免疫应答；而VLPs包裹pcDNA3.1-HPV16 L1基因的VLPs-DNA疫苗则能有效刺激机体产生针对HPV16亚型的特异性抗体和中和抗体；同时能刺激机体产生明显高于单独VLPs疫苗的特异性T细胞免疫应答。这一结果表明VLPs-DNA疫苗在刺激免疫保护反应方面具有更好的表现，可以作为新型宫颈癌疫苗的一个研究方向。　　L1蛋白是HPV主要抗原蛋白，是VLPs疫苗研究的关键，因此快速、便捷的L1蛋白检测方法对HPV VLPs疫苗的研发具有重要意义。本研究采用HPV16 VLPs免疫BALB/c小鼠，制备抗HPV L1蛋白的单克隆抗体，并对单克隆抗体的相关特性进行了分析，在此基础上建立一种快速的检测L1蛋白的免疫层析试纸检测方法。免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞 NS0融合后经多轮筛选，本研究共获得5株与HPV16 L1蛋白特异性反应的单克隆细胞株；采用分16段表达的HPV16 L1蛋白重叠多肽进行捕获ELISA和Dot-ELISA检测，结果显示：多肽162K~196I与单克隆抗体G5、F6和D7发生特异性反应；多肽378L~435A与单抗D3反应；多肽430K~461Q能与单抗C6反应。经间接免疫荧光及Western Blot实验证实5株单抗与HPV6、HPV11、HPV18、HPV33、HPV45、HPV58等亚型的L1蛋白的交叉反应性有明显差异：C6单抗与HPV6、HPV11、HPV58及HPV45亚型L1蛋白有交叉反应；D3与D7单抗与HPV6及HPV45亚型L1蛋白有交叉反应；G5单抗与HPV18、HPV33、HPV45及HPV58亚型L1蛋白有交叉反应；而F6单抗及商品化抗HPV16单抗与HPV6、HPV11、HPV18、HPV33、HPV45、HPV58等亚型的L1蛋白均有交叉反应。用胶体金标记F6单抗初步制备快速检测试纸，实验结果显示该试纸可用于检测 HPV16、HPV6、HPV11、HPV18、HPV33、HPV45及HPV58等亚型L1的蛋白，这为HPV L1蛋白的检测提供支撑，也为HPV基因工程亚单位疫苗的研究提供便利。　　总之，本研究采用大肠杆菌表达系统成功表达了HPV16 L1蛋白，经重组蛋白纯化、自组装，获得HPV16 VLPs，并证实该VLPs疫苗能够刺激机体产生高滴度的中和抗体；通过对HPV16 VLPs包裹HPV16 L1基因的VLPs-DNA疫苗的探索性研究，验证了该类疫苗能够更有效地刺激B细胞和T细胞免疫应答，为宫颈癌新型疫苗的研发进行了有益的探索。本研究制备了抗HPV16 L1单克隆抗体和HPV L1蛋白胶体金免疫层析快速检测试纸，为HPV L1疫苗研究和抗原检测提供了快速、简便的技术手段。同时，本研究对于其他亚型HPV疫苗的研制也有一定的参考价值。