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白细胞介素21(interleukin-21,IL-21)主要由激活的CD4 T细胞产生,通过结合白细胞介素21受体(interleukin-21 receptor,IL-21R)进而发挥多种不同的生物学功能。在许多的哺乳动物白细胞介素21的研究中,IL-21可以影响多种免疫细胞的生命周期(包括增殖、生存、分化)和免疫学功能。在哺乳动物的研究中IL-21R m RNA主要转录于脾脏,胸腺和其他淋巴组织以及一些非免疫细胞,如黏膜组织(肠)的上皮细胞和内皮细胞。因此,IL-21作用于多种细胞类型。从受体分布的细胞类型上表明IL-21对免疫应答的调节具有重要多效作用。随着全球气候的变化,近年我国水产养殖产业中病害频发,直接对养殖生产者造成经济的巨额损失。对于日益增长的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)产量需求,我们需要更进一步对病原感染条件下的草鱼的免疫应答进行研究分析。为了进一步了解草鱼IL-21在病原刺激条件中的表达与功能。本研究通过PCR技术与生物信息学分析,鉴定出草鱼中IL-21和IL-21R的同源物Ci IL-21(Ctenopharyngodon idellus interleukin-21),Ci IL-21Rα(Ctenopharyngodon idellus interleukin-21 receptorα-chain)。通过腹腔注射柱状黄杆菌FC(Flavobacterium cloumnare)和草鱼GCRV-II病毒(Grass Carp Reovirus II),并应用实时荧光定量PCR技术,分析Ci IL-21与Ci IL-21Rα在肾脏,脾脏,鳃和肠道中各时间点的转录水平。使用梯度浓度的r Ci IL-21蛋白(Ci IL-21 recombinant protein)刺激从草鱼肾脏中分离的原代细胞,进行Ci IL-21的生物学功能分析,检测了IL-1β、IL-8、IL-10、IL-22、Ci IL-21Rα、IFN-γ的表达。为了进一步清楚Ci IL-21在病原体刺激下在组织中的亚细胞定位,使用r Ci IL-21制备小鼠单克隆抗体,并通过冷冻切片技术与激光共聚焦显微镜,在FC与PBS等体积腹腔注射草鱼后,取草鱼中肾与后肠进行Ci IL-21的组织细胞亚定位。主要获得的研究结果有:1.验证Ci IL-21 CDS(Sequence coding for aminoacids in protein)区全长,450bp,具有6个外显子,5个内含子,其结构与斑马鱼IL-21结构一致。Ci IL-21蛋白由149个氨基酸组成,但是其130个氨基酸的成熟肽,是经过剪切19个氨基酸大小的信号肽后形成。Ci IL-21蛋白具有4个保守的半胱氨酸,4个alpha螺旋结构域符合Ⅰ型细胞因子的特征。通过构建系统发育树,鉴定Ci IL-21与已知白细胞介素2家族成员的同源关系。发现斑马鱼,草鱼IL-21聚为一小枝,自举值为100%,有很高的同源性。2.获得Ci IL-21RαCDS区全长,1593 bp,具有7个外显子,6个内含子,其结构与斑马鱼IL-21Rα(IL-21r.1)结构一致。Ci IL-21Rα全长编码530个氨基酸,具有34个氨基酸大小的信号肽。Ci IL-21Rα成熟肽的胞外区有213个氨基酸,且在胞外区具有典型的Ⅰ型细胞因子受体结构域:胞外区的前端有两对保守的半胱氨酸,一个保守的WS-X-WS氨基酸基序。鉴定Ci IL-21Rα、IL-2Rα、IL-15Rα,IL-21Rα的同源关系,发现斑马鱼,草鱼IL-21Rα聚为一小枝,自举值为100%,有很高的同源性。3.Ci IL-21与Ci IL-21Rα的组织表达及病原感染分析。通过实时荧光定量PCR技术,获得Ci IL-21在鳃,肠,体肾,头肾,脾,皮肤,胸腺,肝八个组织中的表达情况,结果显示Ci IL-21在鳃,肠道表达最高,在皮肤中表达最低;Ci IL-21Rα在脾和鳃中表达最高,在肝脏中表达最低。在柱状黄杆菌感染实验中,分别收集了1 d,2 d,3 d三个时间点的鳃,肠,肾,脾四种组织,发现Ci IL-21与Ci IL-21Rα均出现了显著性上调变化。在GCRV-II感染实验中,分别收集了1 d,3 d,7 d和14 d四个时间点的鳃,肠,肾,脾四种组织用于研究了Ci IL-21与Ci IL-21Rα的表达情况。两次病原感染实验,Ci IL-21和Ci IL-21Rα表现出先下调,后上调的现象,且均出现显著性变化。4.获得了r Ci IL-21和r Ci IL-21Rα重组蛋白。为了评估r Ci IL-21的生物学活性,通过稀释复性包涵体,并将r Ci IL21蛋白浓缩,经过AKATA纯化系统,收集单体r Ci IL-21蛋白,然后分别使用5 ng/m L,50 ng/m L,500 ng/m L三种效应终浓度的r Ci IL-21蛋白刺激从草鱼肾脏中分离的原代肾脏白细胞。刺激浓度为50 ng/m L时,检测到IL-10,IL-22,IFN-γ均显著性上调,但其他细胞因子未检测到显著性变化。5.获得了较好特异性的Ci IL-21单克隆抗体。分别获得并使用原核表达系统,真核表达系统以及草鱼内源性的Ci IL-21蛋白,通过Western blot技术验证Ci IL-21单克隆抗体的特异性,筛选到特异性较好单克隆抗体。6.通过冷冻切片以及激光共聚焦技术对草鱼的肾脏,肠,鳃中的Ci IL-21进行免疫荧光定位分析。通过对比发现,经过FC感染24h后草鱼肾脏、肠道组织中Ci IL-21分布增加,但在鳃中变化不明显。上述结果表明在草鱼抵御病原侵入时,Ci IL-21和Ci IL-21Rα在免疫应答中发挥了作用。Ci IL-21可通过上调辅助性T细胞因子IFN-γ(Th1),IL-10(Th2)和IL-22(Th17)发挥免疫调节作用。