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目的1.探讨lncRNA-UCA1在乳腺癌中对NK细胞介导免疫耐受的生物学作用及其相关机制。2.探讨乳腺癌肿瘤组织中lncRNA-UCA1的表达与预后的相关性。3.探讨乳腺癌患者外周血25羟基维生素D水平与乳腺癌患者临床病理特征及患者外周血NK细胞水平的相关性。方法1.通过NK-92细胞多次杀伤诱导耐NK杀伤的乳腺癌细胞MDA-MB-231/RNK和MCF-7/R-NK。2.收集3名健康志愿者的外周血通过Ficoll密度梯度离心法获得人外周血单核细胞(PBMCs),再用磁珠分选从中收集NK细胞并通过流式细胞技术验证,通过非放射性细胞毒性分析试剂盒分别检测NK-92细胞和提取出来的原代NK细胞对MDA-MB-231/R-NK、MCF-7/R-NK及其亲本细胞的杀伤活性。3.芯片分析MDA-MB-231/R-NK与其亲本细胞之间lncRNAs表达谱差异,并通过QRT-PCR验证筛选出的lncRNA-UCA1。构建UCA1过表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231/UCA1和MCF-7/UCA1,并通过QRT-PCR验证。检测并比较NK-92细胞对UCA1过表达的乳腺癌细胞株和其亲本细胞杀伤活性的差异。4.检测UCA1过表达的细胞株MDA-MB-231/UCA1与其亲本细胞之间转录组的差异,筛出的ULBP2进行QRT-PCR验证。通过QRT-PCR同时比较MDAMB-231/UCA1,MCF-7/UCA1与其亲本细胞之间的ULBP2的表达。通过ELISA试剂盒比较MDA-MB-231/UCA1,MCF-7/UCA1与其亲本细胞之间上清中sULBP2水平。5.探索UCA1促进ULBP2膜脱落的机制,预测其可能是基于ceRNA模式的lncRNA-miRNA-mRNA网络调控,并通过荧光素酶实验和RNA免疫共沉淀验证。6.收集3位乳腺癌骨转移病人的含高浓度sULBP2的AB型血清并加入NK-92细胞的培养基中,分别检测加入富含高浓度sULBP2血清与未经处理的NK-92细胞细胞对乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞杀伤率及其分泌穿孔素、颗粒酶水平。7.原位杂交法检测417例乳腺癌原位肿瘤组织(其中92例病人有配对骨转移组织)中UCA1的表达,探讨乳腺癌原位灶中UCA1的表达与乳腺癌总生存期(OS)的相关性。同时比较92例乳腺癌病人骨转移肿瘤组织与原发灶组织中UCA1的表达差异。8.通过化学发光法检测并分析109例乳腺癌患者外周血血清中25羟基维生素D水平及乳腺癌组织中VDR的表达水平与临床病理特征之间的关系。并进一步研究乳腺癌患者外周血中25羟基维生素D水平与NK细胞数目的关系。结果1.运用NK-92细胞多次杀伤可诱导获得耐NK细胞杀伤的乳腺癌细胞MDAMB-231/R-NK和MCF-7/R-NK。在效靶比(E/T)为8:1、16:1、32:1、64:1时,NK-92和来自3位志愿者的原代NK细胞对MDA-MB-231/R-NK和MCF-7/RNK的杀伤率均低于对MDA-MB-231、MCF-7的杀伤率,差异具有统计学意义(P<0.05)。NK-92细胞杀伤MDA-MB-231/R-NK、MCF-7/R-NK时培养上清中穿孔素、颗粒酶的水平均显著低于NK-92细胞杀伤其亲本细胞时上清中穿孔素、颗粒酶的水平(P<0.05)。提示亲本细胞对NK细胞的杀伤更为敏感。2.MDA-MB-231/R-NK与其亲本细胞通过LncRNAs芯片分析,发现LncRNA-UCA1表达显著上调,并通过QRT-PCR验证MDA-MB-231/R-NK和MCF-7/R-NK与其亲本细胞相比,UCA1均显著上调。构建UCA1稳定过表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231/UCA1和MCF-7/UCA1,NK-92细胞对UCA1过表达的细胞株的杀伤率均低于亲本细胞(P<0.05),说明UCA1与免疫耐受相关。3.检测UCA1过表达细胞MDA-MB-231/UCA1与其亲本细胞转录组的差异,发现NK细胞活化性受体NKG2D的配体ULBP2显著上调。通过QRT-PCR验证,ULBP2在UCA1过表达的细胞株MDA-MB-231/UCA1及MCF-7/UCA1中均显著上调。脱落的可溶性NKG2D配体(sULBP2)与免疫逃逸相关。通过ELISA检测UCA1过表达细胞株培养上清中可溶性NKG2D配体(sULBP2)的水平显著高于亲本细胞。4.通过RNA免疫共沉淀及荧光素酶试验验证UCA1作为ceRNA通过与miR-26b-5p结合发挥sponge功能调节ADAM17促进ULBP2释放。5.与未处理的NK细胞相比,加入富含高浓度sULBP2血清培养的NK-92细胞对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7杀伤率显著降低(P<0.05)。且在培养上清中NK-92细胞分泌的穿孔素(PFP)、颗粒酶B的水平与未经处理的NK-92细胞相比亦显著降低(P<0.05),提示sULBP2参与免疫逃逸。6.UCA1高表达的患者相比UCA1低表达患者5年的总体生存率更低,两组乳腺癌患者的5年生存率分别为57.1%、75.8%(P<0.05)。检测的92例配对的乳腺癌骨转移组织和原位组织中,UCA1在乳腺癌骨转移的肿瘤组织中阳性表达明显高于配对的原位肿瘤组织(16.48±3.73 VS 13.86±3.21,P<0.05)。7.乳腺癌患者外周血中25羟基维生素D水平显著低于乳腺良性肿瘤患者和健康志愿者,乳腺癌患者外周血25(OH)D水平与T细胞免疫功能(CD4+/CD8+)、临床分期、淋巴结是否受累、是否骨转移、PR是否阳性均有显著相关,而与肿瘤大小、ER是否阳性无显著相关性。VDR的表达与ER、PR是否阳性相关。乳腺患者外周血25(OH)D水平与外周血NK细胞数量无显著相关性(P>0.05)。结论1.UCA1参与乳腺癌对NK细胞介导的免疫耐受,UCA1可先上调ULBP2表达同时促进肿瘤细胞分泌ULBP2,即可溶性sULBP2,导致NKG2D被封闭,诱导免疫逃逸。UCA1作为ceRNA通过与miR-26b-5p结合发挥sponge功能调节ADAM17促进ULBP2的释放从而促进免疫逃逸。2.UCA1高表达与乳腺癌的预后不良密切相关。3.Vit D与乳腺癌的发生发展关系密切,但与患者外周血NK细胞数目未发现明显相关性。