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目的:在建立钙化性纳米微粒(Calcifying Nanoparticles CNPs)大鼠肾结石模型的过程中,通过检测肾结石形成过程中不同时间组肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3的表达水平和自噬体的数量变化,测定不同时间组大鼠尿液中Tamm-Horsfall蛋白(THP)的变化和肾脏组织的病理改变以及钙盐晶体形成情况,对CNPs致肾结石形成机制进行初步探讨。方法:利用肾结石患者术中取出的结石标本培养出CNPs,制成CNPs混悬液。48只SD大鼠随机分为CNPs实验组(A组)和空白对照组(B组)。实验组通过尾静脉注射CNPs,对照组注射等量的0.9%无菌生理盐水。分别于注射后3h、6h、12h、24h、1w、2w、4w和8w收集大鼠尿液,酶联免疫分析法(ELISA)检测各时间段尿液中THP的含量,同期处死大鼠,取肾脏组织,利用免疫组化及Western印迹检测法(Western-blotting)测定肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin-1、LC-3在不同时间组的表达部位与含量。每组制作3个透射电子显微镜标本测定不同时间组自噬体的数量及形态。每组取3个肾脏切片行苏木精-伊红(HE)染色观察细胞的病理改变及对钙盐晶体形成情况进行评分。结果:Western印记检测蛋白结果:在注射CNPs后实验组在不同时间段的肾脏组织中Beclin-1、LC-3的表达较对照组明显增强(P<0.05),且在实验组中Beclin-1、LC-3的表达强度随时间增强,到24h到达最高值,其后随时间逐渐减弱(P<0.05)。免疫组化结果:Beclin-1、LC-3在肾脏组织中高表达于肾小管上皮细胞,少量表达于肾小球。在注射CNPs后实验组在不同时间段的肾脏组织中表达Beclin-1、LC-3蛋白的积分光密度值(IOD)较对照组明显增加(P<0.05)。Beclin-1、LC-3蛋白的IOD随时间增加,到24h到达最高值(Beclin-1:15.33±0.42/Hp;LC-3:9.33±0.12/Hp),其后随时间逐渐减弱(P<0.05)。透射电子显微镜结果示:自噬体主要位于肾小管上皮细胞内,在自噬体中可观察到被吞噬的CNPs,与实验组3h组自噬体数量(1.17±0.35/Hp)相比较,24h组前各组的自噬体数量(1.47±0.31/Hp)增加缓慢(P>0.05)。24h组后各组自噬体数量(2.83±0.32/Hp)增加显著,观察期内第8w自噬体的数量(4.70±0.51/Hp)达到最多(P<0.05)。对照组中观察到少量自噬体。自噬体数量与钙盐晶体评分行Pearson相关性分析,相关系数r=0.902(P<0.05)。酶联免疫分析法结果:实验组与对照组相比较,注射CNPs后,实验组各组的大鼠尿液中THP含量与对照组各组相比较,明显高于对照组(P<0.05);与实验组中3h组THP含量(165.89±2.23pg/mL)相比较,24h前各组THP含量(166.03±3.02pg/mL)增加缓慢(P>0.05),24h后各组THP含量明显增加,在观察期内第8w THP含量(177.11±1.76pg/mL)达到峰值(P<0.05)。实验组THP含量与钙盐晶体评分行Pearson相关性分析,相关系数r=0.843(P<0.05)。肾组织苏木精-伊红染色结果示:随着时间延长,实验组大鼠肾小管上皮细胞水肿逐渐加重,在24h最严重且伴部分上皮细胞空泡变性,在1w至8w镜下可观察到部分肾小管上皮细胞颗粒样变性,肾小管管腔内有钙盐结晶体形成,肾小球无明显的病理改变。对照组肾脏组织无明确的病理改变。在实验组中与6h组钙盐晶体评分(1.0分)相比较,1w前各组的钙盐晶体评分(2.0分)增加缓慢,2w后钙盐晶体评分增加显著(3.0分),观察期内第8w钙盐晶体评分最高(6.7分)(P<0.05)。结论:钙化性纳米微粒可损伤肾小管上皮细胞,使细胞发生明显的急性炎症改变,伴随自噬蛋白的急剧增加,到后期随着细胞炎症反应逐渐减轻,自噬蛋白水平逐渐减弱,肾小管管腔内有钙盐晶体形成。自噬蛋白与肾小管上皮细胞损伤程度成平行关系。钙化性纳米微粒感染大鼠后即刻诱导细胞自噬活动,自噬体数量逐渐增加,自噬体与钙盐晶体的形成成正相关关系。大鼠感染钙化性纳米微粒后尿液中的Tamm-Horsfall蛋白含量逐渐增加,且钙盐晶体评分与Tamm-Horsfall蛋白含量成正相关关系。