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TM7SF4蛋白分子结构内含有7个跨膜结构域（TM域），故得名为七次跨膜超蛋白家族成员4(transmembrane7 superfamily member4，TM7SF4)，本研究通过在人MCF-7乳腺癌细胞系中下调TM7SF4的基因表达，运用Cellomics、流式细胞术、PI-FACS法等检测TM7SF4对MCF-7细胞的增殖、凋亡、细胞周期及克隆形成能力的影响;采用qPCR array方法筛选与TM7SF4相关的信号通路中的关键基因，并进一步分析TM7SF4基因与相关信号通路间的关系，进而说明TM7SF4及相关基因在乳腺癌发病机制中的作用。最后，应用免疫组化及Western blot方法检测TM7SF4及相关蛋白在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，以探讨其在乳腺癌发病中发挥的作用。 第一部分 TM7SF4基因的表达水平对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其作用机制的研究 目的： 本研究旨在探讨TM7SF4基因表达水平对乳腺癌细胞生物学行为的影响，进一步探讨TM7SF4基因与信号通路间的作用关系，阐明TM7SF4基因在乳腺癌发生发展中的作用，为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗提供新的理论依据和实验数据。 方法： 1、通过体外培养五株人乳腺癌细胞系SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、T-47D和HCC1937，运用RT-PCR方法筛选出TM7SF4mRNA表达量高且稳定的目标细胞系，用于后续TM7SF4基因的沉默。 2、构建三组慢病毒包装TM7SF4 siRNA序列(TM7SF4 siRNA1、TM7SF4siRNA2、TM7SF4 siRNA3)，分别转染入乳腺癌目标细胞，运用RT-PCR方法筛选出干扰效果最佳组。 3、通过RT-PCR及Western blot方法，检测不同siRNA干扰序列在于扰效果最显著的时间点TM7SF4mRNA和蛋白的表达水平，筛选出最佳的干扰序列; 4、应用Cellomics仪器连续5天检测转染后乳腺癌细胞的生长状态，并绘制出细胞生长曲线，检测TM7SF4对乳腺癌细胞增殖能力的影响; 5、通过PI-FACS方法检测TM7SF4对转染后乳腺癌细胞周期的影响; 6、通过克隆形成实验检测TM7SF4对转染后乳腺癌细胞成瘤能力的影响; 7、通过流式细胞术检测TM7SF4对转染后乳腺癌细胞凋亡的影响; 8、通过qPCR array实验筛选与TM7SF4基因相关的信号通路及发挥作用的分子。 结果： 1.五株不同乳腺癌细胞系中TM7SF4mRNA的表达情况 TM7SF4mRNA除了在MDA-MB-231细胞系中未检测出表达外，在其余四株乳腺癌细胞系(SK-BR-3、MCF-7、T-47D、HCC-1937)中均检测到表达，且在MCF-7细胞系中表达量最高(31.49±2.70)。在其余三株细胞系中的表达量分别为30.49±3.011、30.06±3.108、30.79±3.105。故选取MCF-7细胞系作为后续实验。 2.采用3个不同的慢病毒包装TMSF4-siRNA片段分别转染MCF-7细胞48h、72h及96h TM7SF4mRNA的表达情况 随着干扰时间的延长，TM7SF4-siRNA1、TM7SF4-siRNA2和TM7SF4-siRNA3三个干扰片段均可降低MCF-7细胞内TM7SF4mRNA的表达水平。 3.MCF-7细胞转染TM7SF4 siRNA2后细胞的增殖情况 TM7SF4 siRNA2转染MCF-7细胞后连续培养5天检测每天各组的细胞数:实验组细胞数:239.1±37.7、508.4±52.8、282.2±84.0、308.0±167.1、131.6±82.6;空白细胞组细胞数:382.8±38.0、1115.0±155.9、1426.2±192.4、2468.4±232.6、2903.0±165.7;空质粒组细胞数:380.8±39.0、1090.0±145.9、1426.0±180.3、2379.0±228.6、2855.0±156.6。 4.MCF-7细胞转染TM7SF4 siRNA2后的细胞周期变化 TM7SF4 siRNA2转染MCF-7细胞后实验组处于G0/G1期的MCF-7细胞显著增加(61.87±0.27)，处于S期的MCF-7细胞明显减少(20.31±0.11)，处于G2/M期的MCF-7细胞显著增加(17.83±0.35);而空白细胞组处于G0/G1期的细胞为57.06±0.55，处于S期的细胞为30.42±0.36，处于G2/M期的细胞为12.83±0.55;空质粒组处于G0/G1期的细胞为57.78±1.23，处于S期的细胞为30.11±0.47，处于G2/M期的细胞为13.30±0.79。与空白细胞组及空质粒组相比，实验组处于S期细胞显著减少、G0/G1期细胞阻滞，统计具有显著性差异(P＜0.05)。 5.MCF-7细胞转染TM7SF4 siRNA2后的凋亡情况 TM7SF4 siRNA2转染MCF-7细胞后实验组MCF-7细胞的凋亡率为9.94±0.57。 6.MCF-7细胞转染TM7SF4 siRNA2后克隆形成结果 TM7SF4 siRNA2转染MCF-7细胞后实验组形成细胞克隆集落数目为11±3，空白细胞组为34±2;空质粒组为29±1，实验组与空质粒组比较具有统计学差异(P＜0.05)。经干扰后MCF-7细胞形成克隆集落的数目明显低于对照组。 7.在91种与乳腺癌增殖、凋亡及转移相关的基因中，应用qPCR array方法筛选出5个与TM7SF4基因高度相关的差异性表达基因，并且TM7SF4基因可能通过TRIM24和TP53信号通路发挥促癌作用。 结论： 1.TM7SF4基因可促进乳腺癌细胞的增殖、细胞周期进展、克隆形成并抑制其凋亡。 2.TM7SF4基因可能通过TP53和TRIM24信号通路发挥促癌作用。 第二部分 TM7SF4、Bax及CD44v6蛋白在乳腺癌组织中的表达及与临床病理间关系的研究 目的： 通过分析TM7SF4蛋白与促凋亡因子Bax、促转移因子CD44V6在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平，探讨TM7SF4、Bax与CD44v6蛋白与临床病理之间的关系。 方法： 1、乳腺恶性肿瘤标本切除后15分钟内，分别取乳腺肿块组织及距离乳腺癌肿物边缘1cm以上的癌旁乳腺组织各一块，大小约为1×1×1cm3，避开出血、坏死及钙化区域。用预冷的PBS漂洗组织，冲洗掉附着的血迹后，再用消毒的滤纸吸干液体，一部分组织立即放入冻存管内，投入液氮，后转入-80℃冰箱保存，用于以后蛋白提取行Western blot检测;另一部分乳腺癌组织采用10％的中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，待免疫组化检测使用。 2、乳腺良性病变标本经手术切除后15分钟内，取良性病变组织一块，方法同上，用于免疫组化检测。 3、免疫组化染色结果判读标准:以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为TM7SF4蛋白及Bax蛋白表达阳性细胞;以细胞膜及细胞浆出现棕黄色颗粒为CD44v6蛋白表达阳性细胞。 4、采用免疫组化公式计算每张切片的染色结果，即:HSCORE=∑pi(1+i)，式中，pi代表阳性细胞所占百分比，i表示染色强度(i=0，1，2，3)，其中，染色为:无着色时i=0，浅黄色时i=1，棕黄色时i=2，深棕色时i=3。分别由两位病理学专家对每张切片的免疫组化染色强度进行独立判断。在镜下随机选取5个视野，每个视野内计数100个细胞。HSCORE≥2者为阳性切片。 5、运用Western blot法检测乳腺癌组织及癌旁组织中TM7SF4、Bax与CD44V6蛋白表达水平。 结果： 1.免疫组化结果: 1.1、TM7SF4蛋白的表达情况 TM7SF4蛋白主要在乳腺癌细胞及乳腺导管上皮细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，其在乳腺癌组织中的表达强度明显高于良性乳腺组织。 1.2、Bax蛋白的表达情况 Bax蛋白主要在细胞胞浆内出现棕黄色颗粒，其在良性乳腺组织及乳腺癌组织中均有表达，但在良性乳腺组织中的表达强度高于乳腺癌组织中。 1.3、CD44v6蛋白的表达情况 CD44v6蛋白主要在细胞膜和细胞浆中出现棕黄色颗粒，其在乳腺癌组织中的表达强度显著高于良性乳腺组织。 1.4、TM7SF4、Bax、CD44v6蛋白表达的相关性 TM7SF4和CD44v6蛋白的表达呈现正相关性(P＜0.05);TM7SF4和Bax蛋白的表达呈现负相关性（P＜0.05）。 2.TM7SF4、Bax、CD44v6蛋白在乳腺癌组织中的表达结果: TM7SF4蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁对照组(P＜0.05);CD44v6蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁对照组(P＜0.05);而Bax蛋白在乳腺癌组织中的表达量明显低于癌旁对照组(P＜0.05)。 结论: TM7SF4基因能通过TP53和TRIM24信号通路发挥促进乳腺癌发生发展的作用，并与促凋亡因子Bax及促转移因子CD44v6相互协同参与乳腺癌的发生发展。