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目的:胰腺癌作为恶性程度最高且预后极差的消化道癌症之一,如何提高其整体生存率是当前癌症领域研究的热点之一。胰腺癌早期症状较为隐匿且发病部位处于人体腹部深部,这些特点使得目前临床常规进行的体格检查,影像检查等检查手段难以发现早期胰腺癌。此外,当前临床应用的如CA19-9等肿瘤标志物对胰腺癌的诊断效率较低。这需要研究者进一步阐明胰腺癌疾病进展的分子机制及开发新型诊断生物标志物。外泌体是由细胞分泌到胞外的小胞外囊泡,在细胞间通讯中扮演着信使的角色。外泌体中运载着众多具有生物活性的蛋白质,核酸等物质,这些物质在被受体细胞摄取后能够调控受体细胞的生理功能。在人体的众多体液如血液中富集着大量各个组织细胞所分泌的外泌体,这些外泌体中运载的物质由于有外泌体膜的保护比起血液中游离的物质具有更好的稳定性,这使得外泌体中运载的蛋白和核酸等具有良好的作为诊断标志物的潜能。对于胰腺癌患者,癌症组织会释放大量外泌体,这些外泌体会参与到疾病进展的各个阶段并且在血液中显著富集。目前,对胰腺癌细胞分泌的外泌体在癌症进展中的作用及其作为胰腺癌早期诊断标志物的可能性尚未研究清楚。在本研究中,我们利用前期建立的一对同源但是恶性表型不同的仓鼠胰腺癌细胞系(PC-1.0细胞为高度恶性表型,PC-1细胞为中低恶性表型)进行外泌体提取进而对提取的外泌体进行蛋白质组学研究。组学结果提示锌离子转运体4是在PC-1.0来源外泌体中上调倍数最高的蛋白。有研究报道锌离子转运体4在胰腺癌患者组织及人胰腺癌细胞株中表达量均高于对应的癌旁组织和人胰腺细胞株。这些结果和我们的结果提示锌离子转运体4可能在胰腺癌进展中扮演着重要的角色。但是,目前对于胰腺癌来源外泌体中锌离子转运体4的作用尚未见报道。因此,本研究针对外泌体来源锌离子转运体4在胰腺癌进展中的作用及其作为早期诊断标志物的可能性机制进行了初步研究。研究方法:在本研究中,我们首先将细胞上清依次用0.22μm除菌过滤器,100kd超滤管进行初步处理排除细胞碎片及无关上清蛋白污染。将处理过的上清液进一步使用SBI公司细胞上清外泌体提取试剂盒进行外泌体提取。提取后的外泌体分别通过蛋白质免疫印迹法验证其外泌体标志物的表达情况及通过透射电子显微镜直接观察来鉴定所提取的外泌体纯度。通过试剂盒荧光标记PC-1.0细胞来源的外泌体将之与PC-1细胞共培养,在荧光显微镜下观察其被PC-1细胞摄取情况。通过CCK-8法检测细胞增殖功能,划痕实验法检测细胞迁移功能,Transwell小室法检测细胞侵袭功能来验证PC-1.0来源外泌体在被PC-1细胞摄取之后对其表型的影响。利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对PC-1.0细胞和PC-1细胞来源的外泌体进行差异表达蛋白质筛选。结合差异表达倍数,文献挖掘,公共数据库挖掘的结果在鉴定出的差异表达外泌体蛋白质中筛选候选研究目标蛋白。利用蛋白质免疫印迹法对从PC-1.0/PC-1细胞及人源胰腺癌细胞株AsPC-1/Capan-2细胞提取的外泌体进行蛋白表达量验证。确定锌离子转运体4作为下游研究目标蛋白后,利用短发夹RNA(shRNA)瞬时转染敲减PC-1.0来源外泌体中的锌离子转运体4的表达量并用荧光显微镜观察和蛋白质免疫印迹法确定shRNA的转染和敲减效率。利用CCK-8法检测细胞增殖功能变化,PI染色检测细胞周期变化,划痕实验法检测细胞迁移功能变化,Transwell小室法检测细胞侵袭功能变化来对比与PC-1.0细胞来源的未处理外泌体和锌离子转运体4敲减后的外泌体进行共培养的PC-1细胞的表型变化。通过构建裸鼠皮下成瘤模型,将PC-1细胞种植到裸鼠腋窝下后分别定期注射PC-1.0来源的正常外泌体和锌离子转运体4敲减后的外泌体,在体内环境进一步验证体外实验的实验结论。利用石蜡切片技术及免疫组化技术,对手术切除的裸鼠瘤体进一步验证其锌离子转运体4的表达情况。最后从临床中收集胰腺癌患者,良性胰腺肿瘤患者,胰腺炎患者,胆囊疾病患者及健康志愿者的血清样本,通过利用SBI试剂盒提取血清中的外泌体进一步利用酶联免疫吸附实验(ELISA)来研究其锌离子转运体4的表达情况。最后利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)来检测血清来源外泌体锌离子转运体4的在诊断胰腺癌,胰腺良性肿瘤,胰腺炎,胆囊疾病的诊断效能。在研究中得到的实验结果利用SPSS 19.0软件进行统计分析,所得可量化实验数据以均值和标准差表示,采用student t检验进行显著性分析,p<0.05被认为是具有统计学意义。使用GraphPad Prism 7软件对结果进行可视化作图。结果:1.通过外泌体标志物蛋白质免疫印迹和透射电子显微镜观察证实本研究中采用的0.22μm除菌过滤器-100kd超滤管-外泌体提取试剂盒法能够以较高的纯度提取细胞培养上清液中的外泌体。2.荧光标记实验和体外功能学实验的结果表明PC-1.0细胞来源的外泌体在被PC-1细胞摄取之后能够促进PC-1细胞的增殖,迁移和侵袭能力。3.通过差异蛋白质组学鉴定出154种在PC-1.0细胞来源的外泌体中上调和189种下调(差异倍数>1.5或差异倍数<0.67)的蛋白质,其中锌离子转运体4是在PC-1.0来源外泌体中上调差异倍数最高的蛋白(差异倍数7.152)。利用蛋白质免疫印迹法验证外泌体锌离子转运体4的表达水平在高度恶性表型的胰腺癌细胞系(PC-1.0和AsPC-1细胞)中高于中低度恶性表型的胰腺癌细胞系(PC-1细胞和Capan-2细胞)。4.体内体外功能学实验结果表明外泌体来源锌离子转运体4可以在体外促进胰腺癌细胞的增殖和迁移能力但是对侵袭能力无明显调控作用,在体内可促进种植瘤的生长且生长较快的种植瘤瘤体内锌离子转运体4的表达水平更高。5.临床受试者血清外泌体来源锌离子转运体4的ELISA实验结果表明胰腺癌患者组的血清外泌体锌离子转运体4的表达水平要高于良性胰腺肿瘤患者组,胰腺炎患者组,胆囊疾病患者组及健康对照组。ROC曲线结果提示血清外泌体来源锌离子转运体4的表达水平具有良好的鉴别诊断胰腺癌与良性胰腺肿瘤,胰腺炎,胆囊疾病及健康对照的诊断效能。结论:1.高度恶性表型胰腺癌细胞株(PC-1.0)来源的外泌体在被中低度恶性表型胰腺癌细胞株(PC-1)摄取后能够促进其增殖,迁移和侵袭能力。2.高度恶性胰腺癌细胞(PC-1.0,AsPC-1)来源外泌体中锌离子转运体4的表达水平要高于中低度恶性胰腺癌细胞(PC-1,Capan-2)来源外泌体。3.外泌体来源锌离子转运体4在体外环境可显著促进胰腺癌细胞的增殖和迁移能力而对侵袭能力调控作用不显著。4.外泌体来源锌离子转运体4可促进裸鼠皮下成瘤模型中种植瘤的生长且生长速率更快的种植瘤瘤体中锌离子转运体4的表达水平更高。5.胰腺癌患者血清来源外泌体锌离子转运体4的表达水平高于良性胰腺肿瘤患者,胰腺炎患者,胆囊疾病患者及健康受试者。血清外泌体来源锌离子转运体的表达水平具有良好的鉴别诊断胰腺癌与良性胰腺肿瘤,胰腺炎,胆囊疾病及健康对照的诊断效能。