艾纳香油提取工艺的优化及其抗菌活性的研究

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艾纳香油(Blumea balsamifera oil)是艾纳香提炼艾片过程中的附属产品,因具有高效的抗菌、抗炎、抗氧化等生物活性而受到广泛关注。由于艾纳香油成分复杂且未有统一标准监控从而导致市场上的艾纳香油各成分含量不均,活性不确定。药物中各化学成分及组成是其发挥功效的物质基础,中药新药的质量以物质基础为前提。为此,本文通过体外抑菌试验筛选不同产源艾纳香油的抗菌活性,并寻找艾纳香油中抗菌活性物质;采用加热回流法通过单因素试验及正交试验设计进行艾纳香油的提取,结合提取得率、抑菌圈及抗炎活性(致敏豚鼠回肠试验测定艾纳香油对豚鼠肺组织释放慢反应物质(SRS-A)抑制作用)综合评分筛选艾纳香油最佳提取工艺;采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对抗菌效果好的A9、抗炎效果好的A5、综合评分筛选的B三个艾纳香油进行成分分析。通过体内试验考察艾纳香油对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus,S.aureus)感染小鼠的保护作用;艾纳香油作用S.aureus后通过测定菌的生长情况、电导率变化、大分子物质含量及形态结构改变、核酸及可溶性蛋白含量探讨其抗菌机制。结果显示,(1)不同产源艾纳香油对受试菌株抗菌效果不同,其中对S.aureus、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)抑菌圈直径分别为11.69±0.51mm~16.07±0.29 mm、11.57±0.40 mm~14.41±0.16 mm,其中MIC最值为54.69μg/m L,MBC最值为218.75μg/m L;具有较好抑菌活性的化学成分是Pinene(蒎烯),Linalool(芳樟醇),对受试菌株MIC值分别为≤156.25μg/m L、≤312.5μg/m L。(2)综合评分筛选出艾纳香油最佳提取工艺为A3B2C1D1(B),即艾纳香药材以1∶14料液比在30℃条件下超声辅助浸泡30 min后再浸泡1.5 h,100℃加热回流60 min后收集艾粉,再继续提取4 h后收集的艾纳香油提取得率为0.175%,且对S.aureus、Pseudomonas aeruginosa的抑菌圈直径分别为20.2±0.18 mm和20.34±0.33 mm,最低抑菌浓度(MIC)值分别为9.77μg/m L、13.68μg/m L,最低杀菌浓度(MBC)值分别为19.54μg/m L、27.35μg/m L,对SRS-A生成抑制率为59.2%。从三个工艺(A5、A9、B)提取的艾纳香油中分析出36个共有化学成分,在A5、A9中均有14个化学成分含量超过1%,B中13个,其中(-)-龙脑((-)-Borneol)在A5、A9、B中百分含量均>10%,其余化学成分在不同工艺提取的艾纳香油中占比趋势均不同。(3)不同浓度艾纳香油B不同程度抑制S.aureus致小鼠死亡,其中20 mg/m L艾纳香油显著抑制小鼠死亡(P<0.5),极显著减轻小鼠脾脏肿大、肾脏出现白色斑点,肾组织坏死等现象(P<0.01);≤0.5MIC B溶液作用S.aureus后,在9h内均抑制菌株生长,≥1MIC B溶液在24 h内菌株均无明显生长,2MIC B溶液引起了菌电导率变化,并没有因此引起大分子物质的泄漏,菌体形态遭到破坏,出现不规则褶皱及破碎现象,核酸含量减少,且随浓度增大可溶性蛋白含量明显减少,其中在约75 KDa、135 KDa、245 KDa分子量时蛋白条带变浅较明显。结果提示不同产源艾纳香油体外抗菌效果不同,蒎烯、芳樟醇类化合物可能是其抗菌物质,且化学成分含量占比影响艾纳香油的有效性,建立结合艾纳香油有效性的质量标准是必需的;通过提取得率、抗菌及抗炎活性综合评分获得高品质艾纳香油,降低了(-)-龙脑在油中的含量,使其具有高效抗菌抗炎作用。最佳工艺提取的艾纳香油对S.aureus的生长速率有显著影响,对S.aureus感染小鼠有显著保护作用,且通过影响S.aureus细胞膜通透性而破坏了菌体的完整性,通过影响核酸和蛋白质的合成最终导致菌体死亡,但不直接作用于菌体DNA,这将为艾纳香油质量标准的确立及进一步靶向作用研究提供理论基础。
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