香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究

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香石竹是多年生的草本花卉,作为世界四大切花品种之一,具有很高的观赏价值。由于一般的香石竹瓶插寿命相对较短,影响了其观赏价值。而传统的保鲜方法多会造成环境污染,且成本较高。而将利用基因工程技术,能从根本上改变它的瓶插寿命。本研究从两方面进行:一方面初步探讨了以香石竹的花蕾为外植体的愈伤组织的诱导及植株再生体系的建立,从而为以此为受体的香石竹遗传转化奠定了基础;另一方面将两个不同T-DNA结构的ACO基因转入到射散香石竹内,从而获得PCR阳性植株。研究结果如下:(1)愈伤组织的诱导及分化本研究采用多头红色品种和多头粉色品种为实验材料,以香石竹的花蕾为外植体,就影响愈伤组织诱导的有关因子,包括不同香石竹品种、激素的浓度及种类、蔗糖的浓度、外植体的大小等方面进行了探讨,从而诱导出了香石竹的愈伤组织,并进一步分化成植株。结果表明:不同植物生长调节剂的浓度及其组合对香石竹愈伤组织的诱导率不同,在MS+2.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+9%蔗糖+7.5g/L琼脂的培养基中的诱导率最高,达到85.1%。外植体的大小对愈伤组织的诱导也有很大的影响,花蕾大小长度为1.0-1.5cm时的诱导率最高。蔗糖浓度在一定程度上影响着愈伤组织的分化能力,蔗糖的最佳浓度为3%。(2)遗传转化建立高效的再生体系是提高香石竹遗传转化率的基础。以香石竹的叶片为外植体,建立起了‘安静’、‘想向’、‘华尔兹’、‘火星’和‘苔丝’5个香石竹品种的再生体系。不同品种间再生率存在显著差异,其中‘苔丝’叶片的再生率最高可以达到59%以上,是叶片再生率最高的品种,而‘火星’的叶片再生率最高只有36%。以香石竹‘安静’、‘想向’、‘华尔兹’、‘火星’和‘苔丝’5个品种的叶片作为外植体,利用农杆菌介导法将反义重复ACO和正义重复ACO基因转入到上述5个品种内。实验中以在分化培养基上预培养2d,菌液中浸泡8-12 min,AS浓度为100μmol/L,共培养时间为3天,筛选培养基为MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+Hyg 4 mg/L+Cef 400 mg/L为转化条件进行遗传转化。结果表明:不同品种香石竹抗性芽分化率在选择培养基上存在显著差异,‘苔丝’分化率最高达8.4%,其次是‘华尔兹’(5.4%),而‘火星’没有得到抗性芽;115株抗性苗经PCR检测后得到了23株PCR阳性转化苗。此外,通过提高选择培养中硝酸铵的浓度,可以提高香石竹的遗传转化率。
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