第一部分壬二酸的抗急性白血病效应目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）当前的主要治疗手段仍是化疗,化疗后不良反应及并发症使部分患者不耐受,且多次化疗后出现的耐药伴随着患者的不良预后。壬二酸为九碳直链饱和酸,分子量较小,已有研究证实其对多种恶性肿瘤具有明显抑制效应,但其对AML的作用尚未明确。本研究旨在开发更加高效、低毒的小分子药物,为急性髓系白血病的临床治疗提供新的思路。方法:收集临床初诊的急性髓系白血病的病人骨髓液,分离出原代病人AML细胞（AML-PC）,培养AML细胞系HL60,U937,THP-1,Molm-13。利用CCK-8实验分析不同浓度的壬二酸对AML细胞系及AML-PC的杀伤效应;给壬二酸连接荧光基团合成具有荧光的壬二酸化合物AZA-BDP,在荧光共聚焦显微镜下观察壬二酸进出入细胞的时间及细胞形态结构的变化;利用CCK-8及流式分析检测AZA对正常细胞PBMC、293T、AML12、h FOB1.19、MC3T3-E1活力的影响,明确AZA的生物安全性;JC-1和Annexin V-FITC/PI标记细胞检测壬二酸对细胞凋亡、细胞周期的影响;结果:分别给与不同浓度的壬二酸处理AML细胞和AML-PC细胞24、48、72 h,结果发现壬二酸可以明显抑制AML细胞系及AML-PC的增殖,24h的IC50约在5 m M左右;合成的具有荧光的AZA-BDP在蓝光激发下可发射绿光,根据绿色荧光的强弱变化可以判定壬二酸进出入细胞时间,壬二酸处理后细胞逐渐肿胀并开始出现脂质体空泡化现象;壬二酸处理后的Molm-13-GFP+细胞与对照组相比荧光亮度降低,提示细胞活性降低;流式结果提示AZA可以诱导AML细胞凋亡并使AML细胞周期停滞于G0/G1期但对正常细胞影响很小;结论:壬二酸可以明显抑制AML细胞的增殖,诱导AML细胞的凋亡。第二部分壬二酸通过降低细胞内ROS水平发挥抗AML效应目的:AML病人体内ROS水平较正常人明显升高。高水平的ROS与AML的进展、复发及耐药密切相关。本研究旨在探讨壬二酸可以通过降低ROS水平,降低氧化应激损伤,诱导AML细胞的凋亡从而发挥抗AML效应。方法:培育AML细胞系U937、HL60、Molm-13细胞,收集临床初诊为AML病人的骨髓液,分离出AML病人原代AML细胞（AML patient cells,AMLPC）。利用流式检测AZA处理后细胞ROS水平变化,并检测氧化损伤指标SOD、MDA、GSH、T-AOC等指标的变化;利用CCK-8法检测壬二酸对AML细胞系和AML-PC细胞增殖的影响;壬二酸处理有GFP荧光标记的Molm-13细胞,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光变化;通过与武汉大学物理与科学技术学院合作,设计可捕获AML细胞的微流控芯片,在单细胞水平上检测AZA作用于AML细胞后,细胞形态结构的变化;采用流式分析AZA处理AML细胞后其线粒体膜电位的变化以及细胞凋亡、细胞周期等的变化;运用蛋白质谱分析壬二酸处理THP-1细胞前后的差异蛋白,WEGO分析差异蛋白的生物功能;建立人源AML小鼠模型,检测壬二酸处理前后,AML小鼠疾病缓解情况及抗氧化指标的变化。结果:壬二酸可以明显降低AML细胞内的ROS水平并增加其抗氧化能力;AZA可以抑制AML细胞及PC-AML细胞的增殖,壬二酸处理后的Molm-13-GFP+细胞与对照组相比荧光亮度降低,提示细胞活性降低;单细胞微流控实验结果提示壬二酸处理后的AML细胞逐渐肿胀、凋亡小体出现,最终裂解死亡;CCK8及流式细胞分析提示AZA处理后细胞活性降低、早凋明显增加;蛋白质谱分析提示AZA处理后抗氧化蛋白Peroxiredoxin（Prdx）明显升高,且STRING分析结果提示Prdx与多种抗氧化指标密切相关;WB、PCR及ICH结果提示壬二酸治疗组小鼠抗氧化指标及Prdx水平明显升高,小鼠脾脏浸润缓解,生存期明显延长。结论:壬二酸通过降低ROS水平诱导AML细胞的凋亡,对机制分析发现AZA可以提高Prdx的表达,体内实验提示壬二酸可以通过调控体内的氧化还原水平发挥抗白血病效应。第三部分壬二酸通过调节免疫发挥抗AML效应目的:免疫治疗目前已成为肿瘤治疗领域研究的热点,免疫检查点、Car-T细胞治疗、肿瘤疫苗等治疗手段的兴起使更多肿瘤患者从免疫治疗中获益。本研究旨在探讨壬二酸的免疫调节效应以及其在AML小鼠模型中的作用。方法:收集健康受试者外周血,分离出外周血单个核细胞,然后进一步分离出NK和T细胞,利用CCK-8法检测壬二酸对NK和T细胞增殖的影响;AML细胞系NK和T细胞共培养,采用LDH释放实验检测壬二酸处理前后免疫细胞杀伤效应的变化;采用流式细胞分析壬二酸处理前后免疫细胞活化指标的变化;酶联吸附试验检测壬二酸处理前后细胞因子水平的变化;制备微流控芯片,捕获NK细胞和肿瘤细胞,荧光显微镜下观察NK与AML细胞接触后细胞形态变化;ROS水平及抗氧化能力实验检测壬二酸对ROS水平的影响;建立AML小鼠模型,检测壬二酸处理前后,脾脏NK和T细胞比例的变化及外周血中细胞因子的变化。结果:低浓度的壬二酸可以促进NK和T细胞的增殖,实验结果提示24h的最佳促增殖浓度是10μM,NK和T细胞的增殖率约为152%和210%;共培养结果提示壬二酸处理后的NK和T细胞杀伤活力明显增加;流式细胞分析结果提示壬二酸处理后NK细胞活化指标CD107a和TRAIL（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand）以及T细胞活化指标CD25和CD69比例明显增加;微流控芯片结果提示壬二酸处理后的NK细胞可以更加高效的杀伤肿瘤细胞;体内实验结果提示壬二酸治疗组较生理盐水组相比,小鼠脾脏CD3-CD56+NK细胞及CD4+CD8+T细胞比例明显增加,TNF-α和IFN-γ水平也显著升高,小鼠症状缓解,生存期明显延长。结论:壬二酸可以促进NK和T细胞的增殖和活化,增加免疫效应细胞的细胞毒作用及细胞因子的释放,体内实验提示壬二酸可以通过调节免疫发挥抗白血病效应。第四部分壬二酸激活Notch信号通路发挥抗白血病效应目的:Notch及其下游分子在AML细胞及病人样本中低表达,活化Notch可以抑制AML细胞的增殖。此外,Notch信号通路可以调控免疫细胞的分化、活化以及细胞毒作用。本研究旨在探究壬二酸抑制AML细胞活性和免疫调节的确切分子机制,深入探讨其与Notch信号通路的关系。方法:运用蛋白质谱分析壬二酸处理THP-1细胞前后的差异蛋白,WEGO分析差异蛋白的生物功能;双荧光素酶报告实验检测壬二酸处理后信号通路活化状态的变化;Western blotting和RT-PCR验证Notch及其下游分子表达变化;应用Notch抑制剂RO4929094抑制Notch后,检测壬二酸对AML凋亡的影响及其壬二酸对NK和T细胞的免疫杀伤效应的影响。结果:蛋白质谱分析提示壬二酸处理后共有525个差异蛋白,WEGO分析这些差异蛋白发现其中有10个与免疫功能相关,Notch1、Notch2属于其中上调的两个与免疫相关的蛋白,Western blotting和RT-PCR以及Immunohistochemistry（IHC）结果再次验证了这一结果。Notch信号通路分析提示壬二酸可以活化Notch信号通路,与抑制剂RO4929097合用则被抑制;Notch信号通路被抑制后,壬二酸对AML细胞的杀伤效应明显减弱,诱导NK和T细胞释放的TNF-α和IFN-γ水平也明显降低。结论:壬二酸可以活化Notch信号通路,Notch信号通路激活后一方面可以抑制AML细胞的增殖,另一方面可以发挥免疫调节作用,促进免疫细胞的增殖和分化,增加免疫效应细胞的杀伤效应发挥抗白血病效应。第五部分靶向硫氧还原蛋白还原酶抗AML新策略目的:砷剂作为治疗AML-M3的经典药物临床应用已非常广泛。已有研究证实砷剂和壬二酸都是硫氧还原蛋白还原酶（thioredoxin reductase,Trx R）抑制剂。本研究通过壬二酸与砷剂联合从而构建靶向性更强、高效低毒的Trx R抑制剂,深并入探讨其抗AML效应及作用机制。方法:与武汉大学化学与分子学院合作,构建一系列有机胂用于药物合成;通过酰胺键及酯键链接将壬二酸与有机胂键连,合成壬二酸键连有机胂小分子化合物;培育AML细胞系,利用CCK-8检测合成的小分子化合物的抗AML效能从而初步筛选药物;利用DTNB法、胰岛素端点试验、肽段指纹质谱等方法检测药物对Trx系统的靶向性;通过流式分析和Caspase相关实验检测药物对AML凋亡及周期的影响;Western blotting和RT-PCR以及IHC实验分析药物作用机制;药物血浆稳定性分析及药物代谢动力学分析进一步确认体内实验的可行性;通过人源PDX小鼠模型体内检测药物的抗AML效应。结果:我们通过将壬二酸与有机胂键连,构建了一系列小分子化合物。通过细胞增殖实验,我们筛选出对AML细胞活性抑制最强的A-Z2做更进一步研究。同浓度的A-Z2较壬二酸及有机胂Z2相比,可以明显抑制AML细胞的增殖,平均IC50在1μM左右;A-Z2具有较强的Trx靶向选择性,但对GSH系统无明显影响;A-Z2可以诱导细胞凋亡并使细胞周期停滞于G2/M期;对其作用机制分析发现A-Z2可以通过直接靶向Trx R促进细胞色素c的释放并提高Caspase9和Caspase3的活性从而诱导线粒体途径的凋亡,而且其可以间接抑制NF-kb活性从而促进Caspase8、TNF-a的释放从而增强自身的抗AML效应。A-Z2具有良好的血浆稳定性,药物代谢动力学提示其静脉给药可以很快达到较高的血药浓度。体内实验证实A-Z2可以明显延长PDX的AML小鼠的生存期,流式分析及免疫组化结果提示A-Z2治疗组小鼠骨髓及脾脏浸润明显缓解,且Trx R及Trx水平明显下降。结论:新型Trx R抑制剂A-Z2可以通过靶向抑制Trx R诱导内源性凋亡发挥抗AML效应;靶向Trx R有望为AML的临床治疗提供新的思路。