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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪的急性高度接触性传染病，常引起母猪的繁殖障碍及仔猪发生呼吸道症状为特征的疾病。近年来，PRRSV变异毒株不断出现，给该病的预防和控制带来了新的挑战。采用减毒沙门氏菌通过黏膜感染途径运送DNA疫苗已成为近年来研究的热点。本研究以减毒猪霍乱沙门氏菌crpC78-1株为基础构建了asd基因突变的平衡致死系统，以此系统携带了PRRSV主要抗原基因ORF5基因，探讨PRRS新型疫苗及该平衡致死系统携带、表达外源基因的可行性。主要内容包括：1．豫西地区PRRS分子流行病学调查本研究通过对豫西地区21份阳性病料的ORF5基因扩增、测序表明：21个ORF5基因核酸序列间同源性为96.5%～100%，与JXA1、MLV、VR-2332和LV的同源性分别为96.6%～98.9%，88.4%～89.2%，88.0%～89.5%和66.8%～67.3%。对21份阳性病料的部分Nsp2基因扩增、测序表明：所得到的21个PRRSV流行株的部分Nsp2基因与已报道的美洲株VR-2332的Nsp2基因相比虽不存在核苷酸的插入或突变，但均存在两个位点共计90个碱基的缺失。本研究澄清了豫西地区PRRSV新近流行毒株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征，为本地区PRRS的防控措施的制定与实施提供了理论指导。2．猪霍乱沙门氏菌C78-1株crp asd缺失株平衡致死系统的构建及鉴定以含有自杀性质粒pREΔasd的大肠杆菌χ7213为供体菌、减毒猪霍乱沙门氏菌crpC78-1为受体菌进行接合转移，两步法筛选asd基因的突变株，经PCR及测序表明crp asdC78-1减毒株构建成功，该菌株失去了在DAP阴性环境中生存的能力；不能利用麦芽糖、蔗糖及果糖等碳源，但保留了利用葡萄糖的能力；其血清型与强毒株C78-1一致，能够稳定遗传315bp的缺失片段。然后将asd+的原核表达质粒PYA3493转入crp asdC78-1，经PCR及测序鉴定表明猪霍乱沙门氏菌平衡致死系统crp asdC78-1(PYA3493)构建成功，与强毒株C78-1及猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500相比， crp asdC78-1(PYA3493)毒力分别下降780倍和1.5倍，该系统可作为疫苗活载体来稳定携带外源基因。3．重组PRRSV的ORF5减毒猪霍乱沙门氏菌的构建及鉴定采用RT-PCR的方法扩增得到去除PRRSV ORF5N端信号肽的dORF5基因，并将其克隆至原核表达质粒PYA3493上，得到重组表达质粒PYA-dORF5，进而将PCR及酶切鉴定正确的PYA-dORF5电转化入所构建的猪霍乱沙门氏菌C78-1株crp asd缺失菌。将经PCR及测序鉴定正确的crp asdC78-1(PYA-dORF5)在LB液体培养基中连续传代60代，PRRSV dORF5基因能够稳定遗传；SDS-PAGE电泳及Western blot检测表明，dORF5基因在系统crp asdC78-1(PYA3493)中得到了有效表达，且表达产物具有较好的反应原性，为PRRS新型活载体疫苗的研究奠定了良好的基础。