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鸡是发育生物学中重要的研究模式生物之一,对其保守基因结构和功能的研究不但可以阐述其在发育生物学中的作用,而且得到的结果还可运用到人和哺乳动物疾病的预防和控制上。CDC25磷酸激酶家族是一类在生物进化过程中高度保守的细胞周期调控因子,调节早期胚胎发育；同时在成体中CDC25的异常活化会导致人类一系列高发性肿瘤的发生。近年来对CDC25B磷酸激酶的研究成为发育生物学和肿瘤医学的一个热点,许多研究认为它与多种肿瘤的发生、发展以及预后有关,检测Cdc25B的表达有望成为判断肿瘤细胞有丝分裂指数和增殖能力一个可靠的分子指标。本试验应用自行合成的地高辛标记的RNA探针在鸡成体组织上进行原位杂交的方法,检测Cdc25B基因转录体在鸡十二指肠粘膜的表达情况,以期探明禽类肠道上皮增殖规律和功能分区,并能与哺乳动物中Cdc25B在成体组织上的表达情况进行比较,为研究禽类消化特征和发育的分子机制提供实验依据,并为研究CDC25B的致瘤机理以及合成其抑制剂提供一定的理论依据。试验ⅠCdc25B mRNA探针的合成应用Primer5.0引物设计软件,以GeneBank中登陆序列号为AJ720997的鸡Cdc25B mRNA序列为参照设计引物。提取孵育36h鸡胚胎的总RNA,通过RT-PCR及PCR从鸡的总RNA中扩增Cdc25B目的基因片段,将目的DNA纯化回收后,用TA克隆的方法将目的片段克隆到pGM-easyT载体中然后转化大肠杆菌,挑取阳性克隆,测序鉴定目的片段。分别利用pGM-T easy质粒中T7和SP6启动子及T7和SP6RNA聚合酶,以线性化的Cdc25B/pGM-T easy为模板转录合成正、反义DIG标记的RNA探针。迅速将合成好的DNA探针进行纯化,然后用分光光度计测定探针的标记效率和浓度,正反义探针浓度均接近200 ng/μl,电泳结果表明探针成功合成,可进一步应用于ISHH试验。试验Ⅱ鸡十二指肠粘膜上皮Cdc25B的原位杂交反应通过原位杂交(in situ hybridization histochemistry, ISHH)技术,用实验Ⅰ合成的探针探查Cdc25B mRNA在鸡十二指肠粘膜上皮中的分布情况。结果表明,成年鸡十二指肠肠腺上皮细胞中有丰富的Cdc25B mRNA的转录,其中Cdc25B mRNA探针杂交阳性细胞在肠腺基底部和小肠绒毛中部分别占上皮细胞总数的81.60%±9.63%和36.21%±8.81%。原位杂交阳性产物大部分分布于十二指肠肠腺上皮“干细胞部”和“增生部”细胞的胞质和胞核中,肠腺基底部由下至上,杂交信号逐渐减弱,至小肠绒毛下部消失,转为阴性。在粘膜肌层以及肌肉层里杂交反应呈阴性。本研究从基因水平证明了鸡十二指肠粘膜肠腺上皮“干细胞部”和“增生部”细胞中有Cdc25B mRNA的存在,表明该区域有活跃的增殖过程,以补充绒毛上端死亡脱落的细胞。Cdc25B的表达趋势与哺乳动物上皮细胞增殖分区相一致,推测鸡的肠腺和粘膜上皮也和哺乳动物一样分为肠腺基部的“潘氏细胞-干细胞部”和中部的“增生部”、肠腺上部“成熟部”、绒毛大部分的“功能部”以及绒毛顶端的“脱落部”