miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码小RNA分子,以转录后调节的方式改变靶基因的表达水平。miRNA通常由RNA聚合酶Ⅱ转录生成pri-miRNA,后经Drosha/pasha切割形成70个核苷酸左右的pre-miRNA并在exportin-5等分子的作用下转运出核,在细胞质中由Dicer等加工为成熟的miRNA,最后成熟的miRNA分子与Argonaute蛋白等形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),并作用于特异mRNA的3’UTR从而抑制翻译过程的进行或直接降解mRNA。miRNA在肿瘤的研究中起着重要作用:首先,miRNA的表达具有显著的组织特异性,在不同的人类肿瘤中,几乎所有的miRNA都表现出了不同的表达状态,miRNA表达谱分析可用于鉴定肿瘤的发育起源,对肿瘤进行分类。相较于基于mRNA表达谱的分类方法,miRNA表达谱分析具有更高的精确度,能够更加直接的反映基因功能水平。同时miRNA表达谱作为稳定可靠的生物标志物,也可用于肿瘤的诊断及判断预后。其次,miRNA功能多样,几乎参与了每一个重要的生命过程,包括增殖,凋亡,分化,代谢等等,在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用。研究表明,miRNA表达水平的改变可以引起一系列癌基因和抑癌基因的变化,通过寡核苷酸类物质特异性抑制致癌miRNA的活性,或过表达具有抑制肿瘤作用的miRNA,可能对肿瘤的治疗提供新的思路和有效途径。第三,肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程,涉及基因众多,对miRNA的研究有助于系统性研究基因间的相互作用及肿瘤发生发展的分子机制,为肿瘤的预防、诊断和治疗提供帮助。本研究选用膀胱癌,子宫内膜癌,肺鳞癌及肺腺癌的临床标本及其癌旁组织,分别提取总RNA后利用miRNA芯片技术检测各组癌及癌旁组织差异miRNA,并选择其中有代表性的miRNA进行具体的功能研究,同时对miRNA靶基因寻找方法进行了探索,建立了以mRNA质核比为基础的靶标寻找方法。本论文的主要研究内容包括:①不同肿瘤临床标本中miRNA的表达谱分析;②mir-200b功能研究;③miRNA寻靶策略的建立。本研究所获得的具体结果如下:1、不同肿瘤临床标本中miRNA表达谱分析。通过miRNA芯片技术对膀胱癌、子宫内膜癌、肺鳞癌及肺腺癌的临床标本及其癌旁组织中的miRNA表达情况进行分析,每组肿瘤标本均得到几十条具有显著性表达差异的miRNA,其中包括大部分已知的肿瘤相关miRNA。在差异miRNA中,let-7家族,mir-21,mir-29,mir-125,mir-15,mir-16等在四种不同肿瘤中均存在显著差异。2、mir-200b功能研究。通过表达谱分析得知在子宫内膜癌及其癌旁组织中,mir-200b的表达差异最为显著,同时文献表明mir-200b在其他许多肿瘤中也存在着异常表达,为进一步研究mir-200b的生物学功能,我们将mir-200b转染进入不同的肿瘤细胞系。在HeLa细胞中过表达mir-200b后,细胞能够更快速地通过G1期进入S期,而在生物信息学软件预测的mir-200b的靶基因中,我们发现RND3能够影响细胞周期的进程并具有使细胞停留在G1期的能力,因此我们推测RND3为mir-200b的靶基因。我们将RND3 3’非翻译区上mir-200b的靶位点克隆到荧光素酶报告载体中,重组载体与mir-200b mimic共转染后发现荧光素酶活性发生明显下降,而将两个靶位点分别突变掉后荧光素酶活性回复到正常水平,证明mir-200b可以与RND3 3’非翻译区上两个靶位点可以发生特异性的结合。同时利用荧光定量PCR实验与免疫印迹实验证实了mir-200b可以在mRNA水平和蛋白水平上抑制RND3的表达,RND3确为mir-200b的靶基因。接下来通过与RND3的siRNA进行比较我们发现,RND3的表达被抑制后,其下游分子CCND1的表达量增加,进而使HeLa细胞快速通过G1期进入S期。在膀胱癌细胞系T24中过表达mir-200b后,细胞形态发生明显改变,细胞失去伪足样突起,形状变得不规则,同时划痕修复实验证明转染后的细胞迁移能力下降。在生物信息学软件预测的mir-200b靶基因中,WASF-3能够影响细胞迁移,我们利用荧光定量PCR实验和免疫印迹实验证明mir-200b能够在T24细胞中抑制WASF-3的表达。在transwell实验中,通过与WASF-3的siRNA进行比较我们发现,mir-200b可以降低WASF-3的表达水平并抑制膀胱癌细胞系T24的迁移能力。3、miRNA寻靶方法的建立。①利用RNA伴侣分子Hfq的辅助在体外寻找与miRNA结合的mRNA。Hfq能够结合mRNA和小RNA分子,我们利用凝胶阻滞实验证明了Hfq能够与let-7特异性的结合,通过于poly(A)的竞争实验也证明了miRNA与mRNA结合在不同位点上。接下来我们用His-Hfq与let-7及HeLa细胞3’UTR库进行孵育,通过Ni-His结合树脂纯化获得与Hfq结合的RNA片段,对所获得RNA进行RT-PCR验证,结果发现let-7组合NC组均能得到NRAS条带,说明在实验过程中存在非特异结合,需进一步优化对Hfq蛋白的封闭条件。②利用mRNA质核比的差别寻找miRNA的功能性靶基因。在研究miRNA与靶基因表达关系过程中,我们发现mRNA在细胞质与细胞核的分布比例,简称质核比,与miRNA功能性靶基因之间存在密切关系。因此,我们推测利用mRNA表达量的质核比差异,结合生物信息学分析可以建立一种快速的miRNA寻靶方案。为验证我们的假设,我们选择mir-93为研究对象,分析确定其在HeLa细胞及HepG2细胞中的靶基因。首先,利用生物信息学软件TargetScan,DIANA-microT和MiRtarget2,预测mir-93的可能靶基因,随机选择预测结果中积分相对靠前的数个靶基因为研究对象,包括E2F1,RB1,P21,MXD1,RBL1,RBL2,EGR2。之后,我们利用基因芯片来分析潜在靶基因mRNA在Hela和HepG2细胞中质核比的相对含量并对其进行了qPCR验证。根据质核比的差别,结合生物信息学预测的结果,我们推测Hela细胞中,RBL1是miR-93的可能功能性靶标,E2F1不是;在HepG2细胞中,E2F1是miR-93的可能功能靶标,RBL1不是;而P21,RBL2与EGR2在Hela和HepG2两种细胞中都是miR-93的功能靶标,Western blot结果证实了我们的推测。为了观察是否还可以利用此寻靶策略发现miR-200b新的功能靶标,我们从mRNA质核比芯片中选择分值较高的TFAP2A,SFRS1和CDYL基因,同时作为对照的分值较低的基因MSN ,WASF3,ZEB1进行Western Blot检测,结果与我们推测的一致。综上所述,我们分析比较了移行膀胱癌、子宫内膜癌、肺鳞癌及肺腺癌的miRNA表达谱;预测并鉴定了一条mir-200b的新靶基因RND3,同时首次证明mir-200b能够影响细胞周期;首次提出了miRNA功能性靶标(functional target)的概念,并初步建立了利用生物信息学预测和细胞中mRNA表达质核比变化寻找miRNA功能性靶基因的方法。