论文部分内容阅读
反向遗传技术是近10年来迅速发展起来的一种病毒学研究方法,在研究病毒基因功能和研制新型疫苗方面有广阔的应用空间。新城疫病毒反向遗传系统的成功建立始于1999年,迄今为止已成功拯救的病毒株包括La Sota、Clone30、BC、ZJ1等,但V4株的反向遗传拯救系统尚未见报道。新城疫V4株是1966年澳大利亚学者Simmons分离到的自然弱毒,该毒株是自然无毒株,主要介导细胞免疫,最大优势在于其独特的耐热性,更适合在发展中国家推广使用。本实验首先对实验室保存的V4株进行了三轮的蚀斑纯化,由于V4株属无毒株,其在CEF细胞中很难形成可见的蚀斑,因此我们采用了用胰酶处理V4病毒,并在上层胶中添加尿囊液及Mg2+,这样可以偶尔产生可见的蚀斑,但实验结果重复性很差。得到的各蚀斑克隆株经56℃水浴耐热实验及-20℃反复冻融实验,比较它们的血凝性变化趋势,选择耐热及耐冻融性状更好的克隆株;实验表明,各克隆株之间耐热性存在明显差异,说明保存的V4毒是由不同的克隆株混合在一起的混合体,选择耐热能力最强的11号毒株进行后续实验。同时,对各克隆株F基因内部47-435bp的片段进行扩增、测序,比较序列后表明完全相同,说明保存的V4毒并不存在杂毒污染。设计了13对引物对全基因进行了扩增及测序,并最终获得了V4株全基因序列。序列分析表明V4株基因组全长15186nt,3’端和5’分别存在55nt的leader区和114nt的trailer区,中间部分包括NP、P、M、F、HN及L基因,各基因又由两端的非编码区和中间部分的开放性阅读框(open reading frame,ORF)组成。对各结构蛋白的基因进行了同源性分析及进化树分析,在参比的各毒株中NDV V4株NP、P、F和HN基因都是与QV4株的同源性为最高,分别为99.9%、96.7%、100%、99.8%,M基因与HB92株同源性最高,为99.4%,与QV4株为96.8%;L基因与已知的毒株比较,与HB92同源性最高,为99.4%。设计10对引物分别扩增各个cDNA片段,并最终连接为全长cDNA质粒pFT7-final,使得cDNA片段连接于T7启动子之后;同时构建了polII启动子及NDV特异性核酶控制下的全长cDNA克隆pFpolII-V4-final。在基因组3166bp处设计引物,利用融合PCR技术插入PmeI酶切位点,并在该位点插入了传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要抗原蛋白VP2的开放阅读框,构建了T7启动子控制下的拟表达VP2抗原的V4株全长cDNA克隆pBRT7-VP2。设计引物扩增了V4株3’leader区及5’trailer区,经融合PCR进行融合后与原始载体pPolII-BDV通过NgoMIV、SfiI酶切位点连接为pBR-LT;扩增了绿色荧光蛋白(EGFP)的开放阅读框并利用两末端的ClaI、SphI酶切位点,将其反向插入到pBR-LT中,构建了V4株微基因组pBR-EGFP。pBR-EGFP与辅助蛋白pCIneo-NP、pCIneo-P、pCIneo-NP以及负责产生T7聚合酶的质粒pCAGGS-T7共转染BHK21细胞,可见很强的绿色荧光表达,说明辅助质粒及pCAGGS-T7均可正常工作;通过与pEGFP-N1对照做了对比实验,多质粒共转染的效率约10%左右;而在pEGFP-N1单质粒转染组,转染效率可达到约40-50%,说明共转染的效率较低;以La Sota、V4及F48E9为辅助病毒进行了病毒包装实验,结果表明依靠微基因组两末端的非编码区序列,微基因组可被辅助病毒包装为缺陷型病毒,说明末端序列在病毒的包装过程中发挥了一定作用。虽然最终经过多次重复拯救实验,我们没能获得V4株的救获病毒,但目前已完成的工作已为V4株反向遗传体系的建立打下了坚实基础,在拯救体系及条件上进行改进后,有望于近期拯救成功。本实验首先通过蚀斑纯化的方法对保存的V4毒株进行了三轮纯化,比较了不同克隆株间耐热性及耐冻融性的差异,选择了综合性状更优良的克隆株;完成了该克隆株的全基因组序列的测定,分析了主要结构蛋白NP、P、M、F、HN和L的基因序列,比较了与其他毒株的核苷酸、氨基酸同源性及进化树分类结果,表明保存的V4株是QV4株的传代毒。构建了三个全长cDNA克隆,分别为T7启动子控制下的pFT7-final,II型启动子控制下的pFpolII-V4-final,以及在pFT7-final中插入了IBDV的VP2基因的嵌合cDNA克隆pBRT7-VP2;构建了V4株微基因组pBR-EGFP,共转染实验表明拯救体系及辅助质粒均正常工作;辅助病毒包装实验表明V4株3’leader区及5’trailer区在病毒的包装过程中发挥了一定作用。