背景与目的子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一,发病机制复杂,而且病因尚不明确。其发病率因各个地区经济发达程度不同而各有差异,目前认为与生活方式密切相关1。子宫内膜癌是女性中的全球第六大常见恶性肿瘤,2008年大约有288,000新发病例2。它是女性生殖道最常见的妇科恶性肿瘤,女性第四大常见肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌、肺癌、结直肠肿瘤。在我国,随着社会的发展和经济条件的改善,子宫内膜癌的发病率亦逐年升高,目前仅次于宫颈癌,居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位。目前已知影响预后的重要因素有:临床分期,组织学分级,侵袭深度,淋巴间隙侵犯(LVSI)和组织学分型2,3。通常子宫内膜癌被分为两种类型1:Ⅰ型子宫内膜癌包括那些通常有癌前疾病发生恶变而来,而且多表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的子宫内膜样腺癌。Ⅰ型子宫内膜癌通常分化较好和很少发生转移5。如果在早期阶段得到及时诊断预后较好,5年生存率>80%3,5。Ⅱ型子宫内膜癌主要是那些非子宫内膜组织学类型,特别是浆液性或透明细胞型内膜癌。这类肿瘤表现为高组织学分级,发生在绝经后子宫内膜已经萎缩的背景下,可能与雌激素受体途径无关6。虽然Ⅰ型癌症的发病率较高,约占内膜癌总数的70%-80%,但是仅占内膜癌发病率15%-20%的Ⅱ型子宫内膜癌,占子宫内膜癌引起总死亡率的比例却高达40%以上7。尽管手术,放疗和化疗策略的进步,但复发或晚期子宫内膜癌的女性患者预后仍然很差,中位总生存期(OS)仅有7-10个月8-10。然而,参与这种肿瘤演进的机制尚不清楚,目前认为肿瘤周围的基质以及分子等微环境的变化,可能在肿瘤演进过程中发挥重要作用。早在19世纪,Stephen Paget便第一次提出了“种子与土壤”假说,该假说为肿瘤微环境的概念奠定了基础。Paget预测认为作为“种子”的肿瘤细胞如果能够定居于适合其生长的“土壤”,即远端组织器官,肿瘤细胞必须与它周围的影响因子起协同作用。1975年,Beatrice Mintz Karl和Illmensee正式提出肿瘤微环境的概念,他们将恶性肿瘤细胞注射到发育中的Blastocytes中,惊讶的发现小鼠的Blastocytes发育成完全正常的小鼠。由此他们推测,肿瘤细胞是一种发育中的全能细胞,改变肿瘤细胞的微环境能使促使其逆转为正常细胞。目前肿瘤微环境的变化在子宫内膜癌发生和进展中的重要性得到了广泛的重视。作为微环境重要组成成分,细胞外基质蛋白在肿瘤的进程中起着非常重要的作用,然而它们在子宫内膜癌中的作用和机制却报道不多。SERPINA3属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族的蛋白质,利用系统发育分析的分类方法,按照蛋白质序列的不同,人的serpin可以分为九个亚型(A-I),属于serpin家族A亚型的SERPINA3是一个细胞外蛋白质,它由423个氨基酸组成,包括一个位于氮端的由25氨基酸残基构成的信号肽以及一个具有丝氨酸蛋白活性的serpin结构域。SERPINA3有多个糖基化位点,总分子量是约为55-66kDa。并且与炎性反应,阿尔茨海默氏病,恶性黑色素瘤和胃癌以及结肠癌等相关。文献报道,SERPINA3除具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性外,还能够进入细胞核与DNA结合促进染色体浓缩,抑制细胞分裂,进而,阻滞细胞增殖。本研究中我们组织学和细胞水平检测并分析了胞外基质蛋白SERPINA3的表达与患者临床病理特征和细胞生物学行为之间的关系。为揭示内膜癌的发病机制与研究疾病转归提供新的切入点,并为探寻子宫内膜癌新的治疗靶标提供线索。方法1、细胞培养AN3CA,KLE,Ishikawa,RL95-2,HEC-1A 和 ECC-1 细胞培养含有 10%(V/V)胎牛血清(FBS),100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的适宜培养基。在37℃,5%CO2条件的100%湿度培养箱孵育。2、标本收集我们收集了 2007年10月到3013年5月在南方医科大学附属奉贤医院和常州妇幼保健院的子宫内膜石蜡组织标本和新鲜组织标本,在本研究中选择的所有内膜癌病例包括随访信息和临床数据完整。所有的子宫内膜癌患者手术前均未接受过放疗,化疗,激素治疗或其他相关的抗肿瘤治疗。子宫内膜癌的诊断和组织学分类是采用国际妇产科协会(FIGO,2009)分期标准和世界卫生组织(WHO)提出肿瘤分级标准进行2。3、组织芯片的构建选取并标记HE染色组织切片上具有代表性的肿瘤区域、正常内膜组织相应蜡块,肿瘤组织,正常对照每例选取2个点。将所需的靶组织用直径1.0 mm的吸针从供体蜡块靶区取出,按芯片设计的排列顺序定位装载在受体蜡块中。4、免疫组织化学染色组织切片经70℃烘烤1h去蜡,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水后行抗原修复,0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)100℃抗原修复10min。稀释好的目的抗体,4℃孵育过夜,1二抗室温孵育1h,二氨基联苯胺显色,苏木素复染,中性树胶封片由2名病理医师双盲阅片和评分,结果一致者为最后判定结果。5、实时定量PCR使用Trizol试剂提取细胞中总RNA,根据制造商的说明书通过PrimeScript RT试剂盒通过反向逆转录PCR(RT-PCR)获得cDNA。随后用ABI7300仪上进行实时聚合酶链反应(Real-time PCR)。扩增过程、荧光信号检查、数据储存和分析均由ABI7300型PCR仪自带软件自动完成,所获数据导至Excle进行计算和分析。6、蛋白免疫印迹(Westernblotting)收集细胞,以含有100μMPMSF的细胞裂解液裂解细胞,4℃12000rpm/min离心15min,取上清采用Bradford法进行蛋白质定量。取50μg蛋白上样,经10%SDS—聚丙烯酷胺凝胶电泳分离,转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶37℃封闭1h,稀释好的目的抗体4℃过夜,1:10,000稀释的IRDye 800兔二抗或1:20,000稀释的IRDye 680鼠二抗在室温孵育1小时后,由Odyssey红外成像系统检测。7、瞬转干扰转染细胞转染前1天,将对数生长期的细胞(1×105)接种于6孔培养板,细胞汇合率为40%～50%。把稀释后的siRNA与稀释后的RNAi Mate进行混合,形成转染复合物加入培养细胞,培养6-8小时换液。8、慢病毒包装和细胞转染编码基因全长cDNA或靶向的特异性干扰片段,克隆到慢病毒载体中。利用Lipofectamine 2000共同转染293T细胞进行病毒包装。在转染后48小时72小时收集含有病毒的上清并进行病毒滴度测定。重组慢病毒在polybrene的介导下转染靶细胞。转染后的细胞用嘌呤霉素进行筛选,获得嘌呤霉素耐药的稳定表达单细胞克隆株,并通过实时定量PCR和Western blotting分析验证。9、细胞增殖实验取对数生长期细胞,胰酶消化单个细胞悬液,细胞计数,接种到96孔板,37℃,5%CO2培养箱中孵育,特定时间加CCK-8溶液孵育后,测定各孔光吸收值,连续检测记录结果绘制细胞生长曲线。10、Transwell小室体外迁移实验用无血清的空培配制成细胞悬液。将Transwell细胞趋化小室置于24孔板中,上室种入细胞悬液,下室周加含10%血清的完全培养基。常规培养24h后取出小室,固定,晾干,结晶紫染色。光镜下计数穿膜细胞。11、细胞周期检测细胞用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化于G1/S期,移去胸苷24小时后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞,70%乙醇固定过夜,用RNase酶去除杂质,PI染色流式细胞仪检测细胞分布情况12、流式细胞仪细胞凋亡实验用不含血清的培养基培养细胞,在特定时间用不含EDTA的胰酶消化收集细胞,PI-Annxin V双染,流式细胞仪检测细胞凋亡情况13、统计学方法实验数据采用SPSS11.0软件进行卡方检验,Fisher确切概率法以及t检验。数据如需描述均以X-±S表示,检验水准双侧α=0.05。结果第一部分:SERPINA3在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义1.1在mRNA水平上,SERPINA3在子宫内膜癌组织中表达显著高于正常组织。分析两个独立的数据库,在mRNA水平,SERPINA3的表达量,相比子宫内膜组织其在内膜癌组织表达上调。组织芯片结果同样证明SERPINA3在正常内膜组织中表达量较低,子宫内膜癌组织中明显升高,两组比较差异有显著性(P<0.001)。1.2 SERPINA3和与子宫内膜癌病理分级、临床分期、脉管浸润、淋巴结转移,之间有密切的相关性。免疫组化结果表明SERPINA3表达升高与肿瘤的进展正相关;而与病理分级负相关,在低分化的内膜癌中SERPINA3表达明显高于分化较好的内膜癌组织。发生淋巴结转移的患者中SERPINA3均为高表达,未发生淋巴结转移的患者中高表达患者比例明显较低,为43.26%,两者比较差异有统计学意义(P<0.001)。有脉管癌栓的患者中SERPINA3高表达率达70.96%,而未发生脉管浸润的为43.65%,两者比较差异有统计学意义(P=0.006)。第二部分:SERPINA3在子宫内膜癌细胞中的功能和相关机制研究1.3实时定量PCR检测子宫内膜癌细胞系中SERPINA3的表达情况,选取表达量高的HEC-1A和KLE细胞,利用靶向SERPINA3的小片段干扰RNA干扰SERPINA3在HEC-1A和KLE细胞中的表达后mRNA和蛋白表达水平明显降低。1.4沉默SERPINA3后能够抑制内膜癌细胞增殖能力;在MTT实验中随着测试时间的推移,对照组与干扰组之间增长差异逐渐显现,在72小时后测定两株细胞对照组与干扰组数值时发现两组比较P值均小于0.05。1.5流式细胞术分析子宫内膜癌细胞的细胞周期分布情况。转染SERPINA3 siRNA干扰组的HEC-1A和KLE细胞与对照组细胞相比,G2或M(G2/M)期细胞的比例明显增多。这些数据表明,沉默SERPINA3的表达后,可以将细胞周期进程阻滞在G2/M期抑制子宫内膜癌细胞的增殖。1.6 AnnxinV/PI双染色法观察干扰的SERPINA3表达结果表明,在无血清培养基中培养48h后,SERPINA3干扰组凋亡比率显著增加,两株细胞中沉默SERPINA3表达前后比较P值均小于0.05。1.7 Transwell小室细胞体外迁移实验结果显示干扰SERPINA3表达后内膜癌细胞迁移能力明显减弱。1.8检测在调节细胞周期和细胞凋亡中起重要作用的几个信号途径的激活情况,结果表明沉默SERPINA3表达能够抑制AKT和ERK1/2磷酸化。结论本研究通过收集临床组织样品,小样本筛选候选基因,再通过构建组织芯片,经免疫染色进一步验证。研究了子宫内膜癌中表达上调的胞外基质蛋白SERPIN3的临床意义及其对子宫内膜癌细胞功能影响,并初步探讨了它们发挥作用的信号传递途径,通过上述研究我们得到了以下结论:(1)SERPINA3在子宫内膜癌组织中呈高表达且与子宫内膜癌临床分期及病理分级相关。(2)沉默SERPINA3表达后子宫内膜癌细胞增殖减慢;细胞周期阻滞与G2/M期比例显著增高,进而导致细胞凋亡比率明显增高。(3)沉默SERPINA3表达后子宫内膜癌细胞迁移能力下降。(4)沉默SERPINA3表达后,AKT、ERK1/2磷酸化减少,MAPK及PI3K细胞信号传递通路活性受到抑制。