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盐胁迫严重影响小麦产量,揭示小麦的耐盐分子机理对于解释小麦响应盐胁迫的现象以及培育耐盐性小麦品种具有重要意义。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,植物生长发育及抗逆分子机制研究取得重要进展。长非编码RNA(long non coding RNA, lncRNA)是一种重要的调控类RNA,其在植物响应胁迫中发挥重要作用,而其响应胁迫的分子机制还不清楚。
为研究lncRNA参与小麦耐盐的作用机制,本研究以耐盐小麦品种小偃60和不耐盐品种鲁麦21为材料,经200 mmol/L NaCl胁迫处理,利用转录组测序技术(RNA-Seq)和生物信息学手段鉴定候选lncRNA并对获得的lncRNA及其靶基因进行功能分析和表达模式分析,主要结果如下:
1.对小偃60(XY)和鲁麦21(LM)测序,结果表明获得序列的50%以上比对到基因间区。根据测序结果并结合生物信息学手段共筛选到746个差异表达lncRNA;其中小偃60有675个,鲁麦21有592个。通过分析RNA染色体分布可知,lncRNA在3B和4B染色体的分布频率较高。
2.lncRNA靶基因预测结果表明,746个lncRNA共获得12 948个trans类靶基因,其中靶基因数目小于50个的lncRNA占比为58%。分析靶基因的GO富集情况,富集到生物过程(BP)的数目最多。小偃60和鲁麦21中分别有564和273个靶标mRNA参与富集度前十的BP中,分别有504和379个lncRNA发挥trans调控作用。KEGG分析共得到44条显著路径,小偃60和鲁麦21分别有25和30条表现显著,其中分别有6和4条与植物响应盐胁迫相关。
3.利用qRT-PCR分析5个响应盐胁迫的lncRNA在不同胁迫处理中的表达情况,多数lncRNA在胁迫12 h或24 h时达到表达量的峰值,小偃60根中lnc-693的qRT-PCR结果与测序结果一致。分析5个参与光合作用、物质代谢及氧化磷酸化等路径的lncRNA (包含上述2个lncRNA)及其靶基因在不同组织的表达情况,结果显示lncRNA和靶基因均在小偃60胁迫12 h(XY3)的根中高表达或达到最大表达量,多数基因表现组织和时间特异性。相对保守序列比对结果表明,其中4个有相对保守序列结构。分析lncRNA保守序列的二级结构,其中lnc-184的最低自由能(MFE)最小,其次是lnc-726。lnc-184有多个发夹结构,且碱基配对率较大;lnc-726仅有一个发夹结构,且这个发夹结构配对率为1,稳定性高。
4.得到的746个lncRNA在不同的处理和品种间分布不同,表现胁迫表达特异性, qRT-PCR结果也证明了这一点。这些lncRNA分别参与不同的生物过程和路径。小偃60中的lncRNA通过参与光合作用、氧化磷酸化、黄酮类化合物合成等路径基因的调控来响应盐胁迫,鲁麦21中的lncRNA通过参与物质代谢、物质合成等路径基因的调控来响应盐胁迫。