研究背景原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)是我国常见的恶性肿瘤之一,其年发病率约20/10万,死亡率高居癌症死亡率的第二位。目前原发性肝癌的治疗方式首选外科手术,但限于诊断水平、症状出现较晚等诸多因素,使得手术切除率低(20%)。现由于放射治疗设备和技术的发展,三维适形放射治疗已成为肝癌非手术治疗的主要方法之一。然而,由于肝癌细胞的相对辐射抗拒性,使得肝癌的根治剂量明显高于肝脏的耐受剂量,尤其中晚期肝癌患者多数伴有肝病基础,又限制了放疗剂量的提高,导致肝癌放疗效果不佳。如何提高肝癌的放射敏感性成为肝癌放射治疗的一个难点和方向。放疗主要是电离辐射(ionizing radiation, IR)通过直接作用或间接作用导致细胞DNA的损伤,从而引起细胞死亡。放疗效果不佳,主要有两方面的原因：1、细胞本身原因或其肿瘤细胞微环境保护从而导致细胞对射线不敏感；2、电离辐射后损伤细胞的修复；后者是主要因素。细胞DNA的损伤主要表现为单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB),如未及时修复会导致细胞死亡,丧失其再增殖能力和突变等。现研究认为DNA双链断裂(DSB)的修复是细胞辐射抗拒的主要原因之一。较为公认的修复机制主要有两种：同源重组修复(HRR)和非同源末端修复(NHEJ)。在哺乳动物中,以NHEJ为主。最新研究表明是DSB修复能力而非DSB数目影响细胞的存活。当IR引起细胞DNA断裂时,其第一步就是DNA断裂检测点的出现：复杂的磷酸化级联是启动Checkpoint关键的一步,哺乳动物中,ATM、ATR、DNA-PKcs通过CHK1、CHK2触发监测点反应是起着中心角色；在酵母中,Rad53、Chk1、Dunl磷酸化,Rad9在受损的所有细胞周期中是一个检测反应的介质,也作为ATM的介导者,包括有MDC1,还有乳腺及卵巢的抑癌基因BRCA1。DSB最开始被DNA末端有MR(X)N复合物(Mre11 Rad50 Xrs2/NBS1)检测到的,同时这个复合物还引导修复及端粒的修复。第二步就是机体对DNA断裂的反应：损伤信号发出后,有修复因子、周期调控因子、转录因子的聚集。H2AX的磷酸化(r-H2AX)也是最早出现的现象之一,并与MDC1、MRN(X)、ATM及其他一些有利于稳定的蛋白作用,起到扩大损伤信号的作用。所以检测点产生DNA断裂的反应,而且能调控修复,增强修复的有效性,能在细胞周期阻滞或促进断裂自身修复中起着作用。修复蛋白被募集至DNA断端时,就开始启动修复程序。两种主要修复方式具体如下：1、非同源末端连接(NHEJ)因不考虑同源序列而成为首选的修复方式,它以基本碱基配对的方式直接把末端先连起来。因没有任何修饰,所以难免会有DNA少量插入或消失,对于非同源或不配对的序列来说,这不影响其修复的完成。NHEJ机制主要有三个主要的物质：MRX、Ku、DNA连接酶。当DSB生成时,MRX及Ku快速的把末端连接起来并防止其降解,在其稳定过程中同时刺激连接酶起作用。MRX是NHEJ、HR共有的唯一的蛋白复合物。MRX由Mre11、Xrs2、Rad50蛋白组成,Rad50有高真性的序列及似乎能在分子间连接有助于促进碱基配对及NHEJ反应的连接,Mre11劈开发夹结构行使3‘----5’核外切酶的作用以助于连接断端；Xrs2缠绕DNA末端(与Rad50),能在细胞周期阻滞中其作用。MRX本质作用是圈合DSB及添补连接酶复合物,能起到核酶的作用。在动物中,Ku是很必须的,属于DNA-PK复合物中的一部分,其催化亚基DNA-PKcs是连接断端的因子,所以这可能是在动物中不用MRX的原因。在NHEJ中的作用是保护DSB末端(NHEJ中)及预防5‘末端切除。连接酶有：Lig4/Ligase IV, Lifl/XRCC4、Nejl/XLF。在Ku的存在下,连接酶能连接不能配对及不亲和的DNA断裂端,这种灵活性在修复任何DSB中有很大的潜在的优势。2、同源重组修复(HR)是对DSB分子的改变,如序列相同有高度忠实性,否则可能引起突变或有害的。所需基因主要有RAD52及其家族的RAD50, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RAD59, RDH54, MRE11 and XRS2,所需酶有：DNA nucleases (Exol, Radl-Rad10), helicases (Sgsl, Srs2), topoisomerasesTop3), polymerases (Po132) and ligases may required to complete specific HR reactions.HR有3个步骤：1、其先决条件：5’端切除,MR(X)N复合物中MRE11执行核外切酶目的是移除限制的DSB有利于切除5’断端,MRX的作用只执行更有效的切除；因有Rad50连接,在5’降解中可能没有直接参与但提供有DSB末端圈合的监测点及融核的清除。2、断端插入同源DNA中并进行链改变或交换；3、重组中间物的溶解。HR最核心的部分是杂合双链D-loop的形成及链的置换。这过程主要有Rad51/Rad52重组酶来完成,Rad51片段形成需要RPA, PRA是一个绕3’末端及清除第二产物的复合物,在切除后快速的缠绕DNA末端及直接跟Rad52(酵母)反应。而Rad52几乎用于所有的连接机制。ATM(ataxia-telangiectasia mutation)基因是共济失调毛细血管扩张症(ataxia- telangiectasia, AT)的突变基因,ATM基因定位于人类染色体11q22-23,该基因全长约150kb,编码序列约12kb,共有66个外显子,编码一个由3056个氨基酸残基组成的、约350kd的蛋白质,称ATM蛋白,是一种磷酸化的大分子核磷蛋白,属于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族成员。ATM基因在电离辐射(IR)损伤修复中发挥着重要作用,当IR引起细胞内DNA双链断裂时,损伤信号引起ATM蛋白激活和自磷酸化,ATM二聚体分离,可以和MDC1、MRN(X)等众多因子结合扩大损伤信号和招募修复因子。ATM磷酸化后其表达上调,磷酸化多种下游的靶分子,包括p53、CHK2、BRCA1等；同时将DNA损伤信号传递给DNA-PK; ku蛋白激活,结合在DNA损伤区域,DNA-PKcs与ku蛋白形成一个复合体,直接参与DNA损伤修复；p53是一个关键的DNA损伤检查点蛋白,通过特异性转录后调节机制,p53与下游GADD45或p21相互作用,上调GADD45可以激活JNK和／或p38MAPK信号途径参与细胞凋亡,调控p21可产生细胞G1期阻滞；MDM2是p53基因负调控因子,MDM2与p53结合,通过泛素(ubiquitin)依赖的蛋白酶体(proteosome)途径降解p53；ATM对CHK2的激活进一步磷酸化p53,增加p53的稳定性,Cdc25A/C使CHK2失活,阻止CDKl激活,导致细胞G2期阻滞。其它参与DSB修复有BLM、BRCA1、H2AX、Mre11、NBS1、XRCC4、Rads等。ATM基因是近年来研究肿瘤放射抗拒方面的一个热点基因,LI等证实抑制ATM基因后宫颈癌的放射敏感性有所提高,而在肝癌中此方面的研究较少。本课题组前期实验已证实ATM基因在肝癌患者中是过度表达的。本研究试图应用简单方便的siRNA干扰技术沉默肝癌细胞HepG2中ATM基因,并检测ATM表达沉默后HepG2的放射生物学特征变化,以期了解辐射增敏机制,为下一步选择联合治疗措施达到更好肝癌治疗疗效提供实验依据。研究目的：1、设计并合成能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA序列,分别在mRNA和蛋白水平检测其抑制效率。2、通过小分子RNA干扰技术抑制肝癌细胞中ATM基因的表达,检测ATM基因表达沉默前后及在经X线照射后细胞生物学特征变化。研究方法：1、设计并合成能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA序列。用Ambion公司在线siRNA设计软件确定特异针对人ATM基因的siRNA靶序列,Tnschl法设计选取3条siRNA。利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计ATM基因定量PCR扩增引物,游：5-ACTGGCCTTAGCAAATGC-3’,下游5’-TTGCAGCCTCTGTTCGAT-3’。2、观察转染效率及检测抑制效果。取指数生长期肝癌细胞HepgG2,用lipofectamine2000分别转染3条siRNA,6小时后选带荧光的cy3 siRNA在荧光显微镜下观察转染情况。同时每条siRNA选取3个浓度进行最适浓度筛选实验(25nmol/mL、50nmol/mL、75nmol/mL),逆转录,qRT-PCR确定最适浓度、时间及检测mRNA水平。蛋白质印迹法检测ATM蛋白变化。3、ATM基因表达沉默对肝癌细胞细胞生物学特性的影响选取上述最高效的siRNA序列,转染肝癌细胞HepG2,通过MTT法检测ATM基因沉默后体外增殖的影响。还有转染24小时后分别给予0Gy、6 GyX线照射,流式细胞术检测ATM基因抑制后细胞周期、细胞凋亡的变化情况,中性彗星实验检测细胞DSB情况。结果1、有效siRNA片段的筛选利用在线数据库和软件设计ATM基因干扰片段,瞬时转染肝癌细胞后,荧光显微镜测定三条siRNA片段转染效率都能达到80%。每条siRNA取3个浓度转染进肝癌细胞HepG2中,转染12h后,从肝癌细胞中提取总RNA,测其OD260/OD280为1.96,说明无蛋白质及DNA污染；RNA电泳图显示RNA完整性较好；qRT-PCR检测siRNA浓度为75nmol/mL时抑制效率最高,达到72%。Western blotting显示转染高效抑制ATM基因的siRN序列24h、48h的抑制率分别是70%、78%,相较于siRNANC组及lipofectamine2000组ATM蛋白表达明显下降；而72小时后其蛋白表达逐渐上升。2、ATM基因表达沉默后对肝癌细胞生物学特性的影响。选取高效抑制ATM的siRNA片段转染肝癌细胞24h后,收集细胞,MTT法检测转染HepG2ATM、HepG2NC组及lipofectamine2000三组细胞之间其增殖无明显差异(P>0.05)。转染24h后,给予X线照射,流式细胞仪检测结果显示：在未照射前,3组细胞的各期百分比未见区别,但6GyX线照射24小时后出现明显变化：正常HepG2细胞、HepG2NC组细胞均形成G1、G2峰。而HepG2ATM组G2/M期细胞明显增多,S期细胞所占百分比从31.8%降至11.1%(P＜0.05)。细胞凋亡检测：通过Annexin V-FITC/PI双染流式分析发现,各组细胞在未照射时无明显异常,6GyX线照射24小时后发现正常HepG2细胞、HepG2NC组细胞之间无明显变化(P>0.05),但HepG2ATM组早期凋亡细胞的百分比是HepG2NC组的2倍(P<0.05)。彗星实验显示：HepG2ATM组DNA损伤比正常HepG2细胞、HepG2NC组更明显,HepG2ATM组8h后DNA损伤较4h无显著变化,而HepG2NC组8h后DNA损伤较4h明显减轻(P<0.05)。结论1、筛选出能高效抑制肝癌细胞HepG2中ATM基因的siRNA片段,并取得最佳的转染浓度和最高效抑制时间。2、抑制ATM基因表达后对肝癌细胞增殖无影响。3、ATM基因表达沉默后,同时予X线照射,流式细胞术显示细胞周期G2期细胞明显增多、S期细胞减少；早期凋亡增多。彗星实验显示DNA损伤更明显且影响其修复。表明抑制ATM基因后能抑制肝癌细胞的损伤修复。