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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌复合菌群感染所导致的一种人畜共患病,严重威胁着人类健康,是世界性的公共卫生难题。据世界卫生组织(WHO)报道,近年来结核病“死灰复燃”,全世界约三分之一的人为结核分枝杆菌潜伏感染者,每年新增感染者上千万,死亡人数高达数百万。中国是全球第三大结核病高负担国家,感染人数、患病人数和死亡人数均高于全球平均水平。近年来,耐多药(Multidrug-resistant tuberculosis,MDR)、广泛耐药(Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR)以及HIV共感染等问题的出现与扩散更加剧了结核病的严峻形势。分枝杆菌细胞壁含有大量脂质,约占细胞干重的30~40%,但它们的生物功能、合成途径及其错综复杂的结构仍然是个谜。研究表明,在感染过程中,结核分枝杆菌可积累大量的脂质(包括来自宿主细胞的脂类),并以三酰甘油(TAG)形式储存起来,以维持细菌生存。处于非复制阶段的结核分枝杆菌可在宿主细胞内持续存活几十年,尤其难以消灭。在重新激活的情况下,TAG被用作能量来刺激细胞恢复到复制状态,从而导致活性感染。结核分枝杆菌基因组中有大量的基因编码脂质代谢相关的酶类(约250个),其中,脂解酶可水解细菌储存的脂质,为结核分枝杆菌生存提供能量。这些酶主要分为五大家族:Lip家族、磷脂酶家族、角质酶家族、β-内酰胺酶家族和PE/PPE家族。它们在分枝杆菌的生命周期、持留和毒力中发挥着关键作用。深入研究这些酶的特性与功能,将有助于开发新型抗结核药物和诊断试剂。本课题以结核分枝杆菌H37Rv中Lip家族成员Rv1076(LipU)为研究对象,深入探索了LipU的酶学特性及功能。基于LipU与激素敏感型家族脂酶(HSL)一样,都具有保守的五肽模序“GXSXG”而被注释为脂酶/酯酶。为了确定Rv1076的酶学特性及功能,我们对该蛋白进行了表达纯化,并测定其活性、酶学特性及酶学动力学参数;然后通过定点突变来验证LipU的活性位点残基。同时,将其在耻垢分枝杆菌中的同源基因进行了敲除,以探索LipU的功能;通过细胞因子检测来揭示LipU在宿主免疫应答中的作用。实验结果发现,LipU对短链的对硝基苯酚酯具有高度的催化活性,其最适温度和pH分别为40℃、pH 8.0。LipU的酶活、Km和Vmax值分别为176.7 U/mg,1.73μM和62.24μM/min;离子型表面活性剂对LipU的活性影响较大;将其活性位点Ser140,Asp244和His269突变后,酶活几乎完全丧失。Rv1076在饥饿处理下显著上调;将该基因敲除后,耻垢分枝杆菌对碳源的利用能力降低,表明LipU对于结核分枝杆菌在胁迫条件下的生存具有关键作用。我们将重组蛋白rLipU与巨噬细胞THP-1共孵育后,检测到细胞因子TNF-α和IL-12显著上调,由此表明,LipU参与了宿主免疫应答,具有良好的免疫原性。本研究详细地阐释了结核分枝杆菌LipU的特性与功能,有助于提高大家对Lip家族的认识,并且为其他脂酶的研究提供了参考,为开发新型抗结核病药物和诊断试剂提供新思路。